毛细管电泳实验-13级解答.docVIP

预习要求： ? 1、思考题无论正确与否，需全部作答；最后一道思考题要写原因。 ? 2、预习报告中要包含实验原理，仪器试剂，实验步骤，记录表格。 ? 3、查阅毛细管电泳四种待分析物(苯甲醇、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯甲酸)的pKa值，并标明所查文献或网址。 4.3毛细管电泳法 4.3.1原理 1808年俄国物理学家Von Reuss首次发现电泳现象，即溶液中的荷电粒子在电场作用下会因为受到排斥或吸引力而发生差速迁移。1937年瑞典科学家Arene Tiselius成功地把电泳技术用于人血清中不同蛋白质的分离，因此而获得了1948年诺贝尔化学奖。在传统电泳中凝胶可以抑制因热效应而导致的对流，但如果在自由溶液中施加高的电压，就会导致大的焦耳热，严重影响分离。因此，人们一直致力于减小分离介质的尺寸。1981年美国学者Jorgenson和Lukacs使用内径为75 (m的熔融石英毛细管，配合30 kV的高电压进行自由溶液电泳，获得了高于40万理论塔板数的分离柱效。这标志着毛细管电泳（capillary electrophoresis, CE）作为一种新型分离分析技术的诞生。经过近30年的发展，CE现已广泛应用于无机离子、中性分子、药物、多肽、蛋白质、DNA及糖等各类化合物的分析，并被认为是20世纪分析化学领域中最有影响的进展之一。20世纪90年代后期出现的阵列CE技术作为基因测序的关键方法在人类基因组计划中发挥了极其重要的作用。 CE的的分离原理如图4.6所示。在毛细管中充满缓冲液，将其两端置于缓冲溶液瓶中，当样品被引入毛细管后，在毛细管两端施加直流电压，此时，电渗流带动整个溶液在毛细管中流动，不同的带电粒子因其电泳淌度的不同而发生差速迁移，从而实现分离。与传统的电泳技术相比，CE具有应用范围广、分离效率高、分离模式多、样品用量少、分析成本低、环境友好等特点。 CE有6种分离模式，见表4.14。毛细管区带电泳（CZE）是最简单的模式，因为毛细管中的分离介质只是缓冲液。在电场的作用下，样品组分以不同的速率在分立的区带内进行迁移而被分离。由于电渗流的作用，正负离子均可以实现分离。在正极进样的情况下，正离子首先流出毛细管，负离子最后流出。中性分子由于不带电荷，故随电渗流一起运动，故CZE模式不能分离不同的中性化合物。MEKC和CEC则可同时分离带电的和中性化合物。 图4.6 CE仪器组成示意图 表4.14 6种CE分离模式的分离依据及应用范围 分离模式 分离依据 应用范围 毛细管区带电泳（CZE） 溶质在自由溶液中的淌度差异 可解离的或离子化合物、手性化合物及蛋白质、多肽等 毛细管胶束电动色谱（MECC） 溶质在胶束与水相间分配系数的差异 中性或强疏水性化合物、核酸、多环芳烃、结构相似的肽段 毛细管凝胶电泳（CGE） 溶质分子大小与电荷/质量比差异 蛋白质和核酸等生物大分子 毛细管等电聚焦（CIEF） 等电点差异 蛋白质、多肽 毛细管等速电泳（CITP） 溶质在电场梯度下的分布差异(移动界面) 同CZE，电泳分离的预浓缩 毛细管电色谱（CEC） 电渗流驱动的色谱分离机制 同HPLC 影响CE分离的主要因素有：缓冲液的种类、浓度和pH值，缓冲液添加剂的种类和用量，电压的方向和大小，进样方式和样品的浓度，毛细管的尺寸和温度，以及毛细管内壁的修饰等等。 4.3.2仪器结构与操作 1. 毛细管电泳仪的构成 图4.6所示为CE仪器示意图。其组成部分主要是高压电源、缓冲液瓶（包括样品瓶）、毛细管、检测器以及控制系统。高压电源是为分离提供动力的，商品化仪器的输出直流电压一般为0~30 kV。大部分直流电源都配有输出极性转换装置，可以根据分离需要选择正电压或负电压。缓冲液瓶多采用塑料（如聚丙烯）或玻璃等绝缘材料制成，容积为1~3 mL。考虑到分析过程中正负电极上发生的电解反应，体积大一些的缓冲液瓶有利于pH的稳定。进样时毛细管的一端伸入样品瓶，采用压力或电动方式将样品加载到毛细管入口，然后将样品瓶换为缓冲液瓶，接通高压电源即可开始分析。 目前CE用的毛细管主要是内径为25-100 (m的熔融石英毛细管，外面涂有聚酰亚胺保护层，长度50 cm左右。CE多用UV检测器，由于光线通过毛细管进行“柱上”检测，故没有柱外效应的问题。当然，毛细管的检测窗口处要除去涂层，保证透明。此外，CE还用电化学检测器、激光诱导荧光检测器和质谱检测器等。 2. 毛细管电泳仪的操作 （1）准备工作，包括安装毛细管、连接电源线和信号线，等等。 （2）配置缓冲溶液。根据实验要求配置适当浓度和pH值的缓冲溶液，并经0.45 (m滤膜过滤，再超声波脱气10 min。然后分装到仪器的缓冲液瓶中，置于仪器样品盘上毛细管入口（Inlet）的适当位置。在毛细管出口(Outle