表阿霉素免疫纳米微粒的制备及体外抗肿瘤作用研究.docVIP

表阿霉素免疫纳米微粒的制备及体外抗肿瘤作用研究 　　[摘要] 目的 制备表阿霉素免疫纳米微粒，观察其抗体活性、体外释药及体外抗肿瘤作用。 方法 利用聚电解质复合法合成载表阿霉素纳米微粒（E-ADM-NPs），化学交联法合成载表阿霉素的抗血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）单克隆抗体纳米微粒。ELISA法检测表阿霉素单克隆抗体纳米微粒（E-ADM-Ab-NPs）的抗体活性，紫外分光光度计测定其体外释药量，MTT法检测其对人肝癌细胞的体外杀伤效应。 结果 E-ADM-Ab-NPs的平均粒径为（190±21） nm，抗体活性保存良好；体外释药试验表明，E-ADM-Ab-NPs具有缓释特性，10 d累积释药量可达93.46%；E-ADM的体外杀伤效应在1～6 d呈时间依赖性，而E-ADM-Ab-NPs则在1～10 d均呈时间依赖性，6 d时两者的杀伤效应均呈剂量依赖性，且两者间差异无统计学意义（P 0.05）。 结论 E-ADM-Ab-NPs具有药物缓释效应和免疫活性，可延长表阿霉素（E-ADM）对人肝癌细胞的有效作用时间，且并未影响E-ADM的生物学活性。 　　[关键词] 表阿霉素；载药纳米微粒；聚电解质复合法；缓释作用；血管内皮生长因子；肝癌 　　[中图分类号] R730.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）06（a）-0077-03 　　载药纳米微粒因其具备良好的生物相溶性、单核吞噬细胞系统靶向性、表面可修饰性和缓释性等特点，日益成为肿瘤靶向治疗领域研究的热点[1-2]，但如何改良载药纳米微粒的制备条件、如何增加携带肿瘤特异性单克隆抗体的稳定性等问题仍有待进一步完善提高。本研究在前期研究中以海藻酸钠和阳离子瓜尔胶为载体材料，利用操作简便且反应温和的聚电解质复合法制成载表阿霉素纳米微粒（E-ADM-NPs）[3]。本研究将进一步探讨抗血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）单克隆抗体与E-ADM-NPs的交联，并观察表阿霉素单克隆抗体纳米微粒（E-ADM-Ab-NPs）的抗体活性、体外释药及对人肝癌细胞株的体外杀伤效应，为荷瘤动物体内实验研究提供可靠的依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料 　　盐酸表阿霉素（法玛西亚公司，批号56390-09-1）；海藻酸钠（温州东升试剂厂，批号9005-38-3）；阳离子瓜尔胶（美国Economy公司，批号65497-29-2）；抗VEGFR2单克隆抗体（美国Biodesign公司，批号A00355）；碳化二亚胺（EDC）（美国Pierce公司，批号CB4403030）；噻唑蓝（MTT）（Sigma公司，批号050609）；人肝癌Bel 7402细胞株（由中科院上海细胞生物研究所提供）。 　　1.2 E-ADM-Ab-NPs的制备及抗体活性检测 　　依据前期研究结果[3]，利用聚电解质复合法制备E-ADM-NPs和未载药NPs。称取E-ADM-NPs和未载药NPs各10 mg，分别与2 mg 抗VEGFR2单抗溶于pH值7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）中，缓慢加入5 mg EDC，4℃条件下搅拌2 h后静置过夜。将所得溶液离心后用蒸馏水洗涤3遍，冷冻干燥即可制得E-ADM-Ab-NPs和未载药Ab-NPs。利用动态光散射粒径分析仪测定E-ADM-Ab-NPs的粒径分布，扫描电镜下观察其形态。参考文献[4]利用酶联免疫测定法（ELISA）对E-ADM-Ab-NPs中抗VEGFR2单抗的活性进行检测，以450 nm波长处的吸光度值（OD450）计算抗体活性保存率，抗体活性保存率=（E-ADM-Ab-NPs OD450/抗VEGFR2单抗OD450） ×100%。 　　1.3 E-ADM-Ab-NPs的体外释药试验 　　称取E-ADM-Ab-NPs粉末20 mg装入透析袋内封严，置于装有100 mL PBS（pH值7.4）的锥形瓶中，在（37.0±0.5）℃的水平恒温振荡器内进行动态透析（频率为60 r/min）。分别于0.5、1、4、8、16、24、48、96、144、192、240 h后吸取15 mL PBS作为样品，同时补充相同体积的新鲜PBS。测定样品在477 nm波长处的吸光度值，依据标准曲线方程计算不同时间点E-ADM的释放量，绘制E-ADM-Ab-NPs体外释药曲线。 　　1.4 E-ADM-Ab-NPs的体外抑瘤试验 　　取对数生长期的人肝癌Bel 7402细胞悬液（1×105个/mL）接种于96孔细胞培养板，每孔90 μL，37℃、5%CO2中培养24 h后随机分为4组：两个实验组分别加入10 μL不同浓度的E-ADM-Ab-NPs和E-ADM，两个对照组则分别加入10 μL Ab-NPs和培养液。分别继续培