分子生物学技术6.ppt

分 子 生 物 学 技 术 第二节 PCR Polymerase Chain Reaction 原理： 反应体系： 含有目的基因或序列的DNA模板 热稳定的DNA聚合酶（Taq酶） 一对脱氧寡核苷酸引物（primer） 4种脱氧核苷三磷酸(dNTP) Buffer及Mg2+等 PCR技术原理 反应过程： 变性：升高温度使模板DNA变性、双链分开； 退火：再降低温度使引物与模板DNA配对互补结合； 延伸：然后升温到聚合酶反应适宜的温度，此时在聚合酶催化下，从引物3’羟基端开始，与模板DNA上的碱基配对逐个加上核苷酸，合成新的DNA链。 循环：其后再按高温变性、低温退火、适温合成三步反复循环，新合成的DNA在下一循环中又作为模板使用，每循环一次，合成的目的序列扩增一倍 PCR反应条件的优化： 引物设计: 长度18-24bp 避免3端的互补, 否则容易造成DIMER 避免内部形成二级结构 退火温度： 熔解温度（Tm）是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度； 合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃； 镁离子浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带 循环次数：当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA 浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR 产物中非特异性产物大量增加 Hotstart PCR（热启动PCR） 热启动主要是通过抑制PCR反应体系一种基本成分，延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。避免了起始循环较低温度下的非特异性扩增，提高了PCR反应的灵敏度及特异性 。例如： HotStart Taq酶是经过化学修饰的耐热DNA聚合酶。此酶在常温下，活性被封闭，要在94-95 ℃加热数分钟才能回复 正常活力开始反应。 Touchdown PCR（降落PCR） 通过在PCR 的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm 高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1℃到2℃，直到退火温度低于Tm约 5℃。特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势 Nested PCR （巢式PCR） 巢式RT- PCR,这种方法的特点是需要设计两对引物，一对引物扩增稍长片段，在这一扩增范围内再设计一对引物，扩增的产物是以第一对引物的产物为模版 套式RT-PCR通过内外引物进行两次扩增，大大提高了检测的敏感性 PCR技术的发展和应用： RT-PCR 不对称PCR 反向PCR 锚式PCR 原位PCR 荧光定量PCR RT-PCR: 提取组织或细胞中的总RNA 以其中的mRNA作为模板，以： Oligo（dT）或 随机引物 或 基因特异性 为引物，利用逆转录酶反转录成cDNA。 以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达 以mRNA为模板经RT合成cDNA，末端转移酶在cDNA3′末端加上poly(dG)尾。Poly(dC)锚定引物与poly（dG)尾互补结合引导合成未知DNA序列 原位PCR 原位杂交PCR首先将样品组织切片或细胞涂片，然后固定在载玻片上； 适当预处理后，将细胞核内的DNA加热变性形成两条单链DNA。 针对待检测的选定序列设计一对引物，直接将引物dNTP缓冲液及TaqDNA聚合酶加到载玻片上 在原位聚合酶仪内进行PCR扩增 反应完毕后将PCR产物固定在载玻片上 用相应的检测信号系统进行检测。可以检测组织细胞中微量DNA或RNA，且可精确定位 PCR和原位PCR在概念上有什么区别？ PCR是提取细胞或组织中的DNA进行基因扩增反应，而原位PCR是保持细胞或组织的完整性，使PCR反应体系渗透到组织和细胞中，在细胞的靶DNA所在的位置上进行基因扩增，不但可以检测到靶DNA，而且还可以了解靶DNA存在于何种细胞中，更有利于探讨靶DNA与细胞之间的关系。 原位PCR实验主要的应用范围有哪些 （1）检测外源性基因片段，提高检出率，集中在病毒感染的检查上，如HIV、HPV、HBV、CMV等；（2）观察病原体在体内分布规律（3）内源性基因片段，如人体的单基因病、重组基因、易位的染色体、Ig的mRNA片段、癌基因片段等。（4）检测导入基因；（５） 遗传病基因检测如β－地中海贫血。 定量PCR： 荧光实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 。 常用的荧光标记方法可简单分为两大类： 非特异检测——双链DNA内插式荧光染料；代表是SYBR Gree