实验三 离心技术.docVIP

实验三 离心技术 一．概念 生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离的一种技术。沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。主要应用于各种生物样品的分离和制备。 二．基本原理 1．离心力（F） F = m·a ＝ m·ω2r2 a：粒子旋转的加速度 m：粒子的有效质量 克为单位 ω：粒子旋转的角速度 弧度/秒 为单位 r：粒子的旋转半径 cm为单位 2．相对离心力（RCF）relative centrifuge force 通常离心力常用地球的引力的倍数来表示，因而称为相对离心力（RCF）。或者用数字×g来表示，例如：13，000g，则表示相对离心力为13，000。相对离心力指在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度g（980cm/s2）。 RCF=ma/ mg= mω2r2/mg=ω2r2/g ω=2π×rpm/60 ∴RCF=1.119×10－5×（rpm）2r rpm：revolutions per minute为每分钟转数 由上式可知，只要给出旋转半径r，则RCF和rpm之间可以相互换算。 由于转头的形状及结构的差异，每台离心机的离心管从管口至管底的各点与旋转轴之间的距离是不一样的，所以在计算时规定旋转半径均用平均半径rav代替： rav＝（rmin＋rmax）/2 低速离心时常以转速rpm来表示，高速离心时则以g表示。报告离心条件时使用RCF比rpm要科学，因为它可以真实地反映颗粒在离心管内不同位置的离心力及其动态变化。 三．离心机的主要构造和类型 1．离心机的分类 工业用离心机 制备性离心机：分离各种生物材料、分离的样品量比较大 实验用离心机 分析性离心机：研究纯的生物大分子和颗粒的理化性质，一般有光学系统，可监测粒子在离心场中的行为，能推断物质的纯度、形状和分子量等，都是超速离心机 制备性离心机分为： （1）普通离心机 最大转速6000rpm左右，最大RCF接近6000g，容量为几十毫升至几升，分离形式是固液沉降分离，其转速不能严格控制，通常不带冷冻系统，室温操作，用于收集易沉淀的大颗粒物质，如：细胞等 （2）高速冷冻离心机 转速为2000－25000rpm，最大RCF为8900×g，最大容量可达3L，一般都有制冷系统，以消除高速旋转转头与空气之间摩擦而产生的热量，离心室的温度可以调节和维持在0℃－4℃，可以严格准确的控制转速温度和时间，并有指针或数字显示。通常用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、硫酸铵沉淀和免疫沉淀物等的分离纯化工作，但不能有效地沉降病毒、小细胞器、或单个分子。 （3）超速离心机 转速可达50000－80000rpm，RCF最高可达510000×g，离心容量由几十毫升至2升，分离形式为差速沉降分离和密度梯度区带分离，需严格配平（误差0.1g）。可分离亚细胞器、病毒、核酸、蛋白质和多糖等。 2．转头 （1）角式转头 角式转头是指离心管腔与转轴成一定倾角的转头。一般有4－12个装离心管的离心管腔，离心管腔的中心轴与旋转轴之间的角度在20°－40°之间，角度越大沉降越结实，分离效果越好。 壁效应：颗粒在沉降时先沿离心力方向撞向离心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一侧就会出现颗粒沉积，此现象称为“壁效应”。 （2）荡平式转头 吊篮式 （3）区带转头 （4）垂直转头 （5）连续流动转头 3．离心管 （1）制作材料 塑料：聚乙稀（PE）,聚碳酸酯（PC），聚丙烯（PP），PP性能较好 优点：透明或半透明，硬度小，可用穿刺法取出梯度。 缺点：易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短 不锈钢： 优点：强度大，不变形，能抗热、抗冻、抗化学腐蚀。 避免接触腐蚀性的化学药品，如：强酸，强碱等。 （2）离心管盖 离心前必须盖严，配平时需带管盖重量 管盖作用： 防止样品外泄 防止样品挥发 支持离心管，防止离心管变形 四．制备性超速离心的分离方法 1．差速沉降离心法 最普通的离心法，采用逐渐增加离心速度或低速、高速交替进行离心，使不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法，此法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。 差速离心首先要选择好颗粒沉降所需的离心力和离心时间。当以一定的离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出的上清液在加大转速下再进行离心，又得到第二部分较大较重颗粒的沉淀及含较小和较轻颗粒的上清液，如此多次离心处理，即能把液体中的不同颗粒较好地分离开。此法所得的沉淀是不均一的，仍杂有其它成分，需经过2～3次的再