第17章 体内药物分析简介【参考】.pptVIP

体内分析方法 RP-HPLC 色谱柱——ODS色谱柱 流动相——甲醇(乙腈)-磷酸(枸橼酸) 缓冲液(三乙胺调节pH2.3～3.5) 检测——紫外或荧光检测 生物样品预处理方法 ?蛋白沉淀法——甲醇、乙腈或高氯酸沉淀蛋 白后直接进样 ?溶剂萃取法——二氯甲烷-异丙醇、 氯仿-异丙醇混合溶剂提取 ?蛋白沉淀-溶剂萃取法—乙腈沉淀蛋白后 二氯甲烷-异丙醇提取 分析方法设计 1．分离检测方法 本试验为生物等效性研究 ——测定血浆中环丙沙星原形药物的血药浓度-时间曲线。 初步拟定：采用RP-HPLC法 紫外或荧光检测 紫外——灵敏度＜1ng，若取血浆0.5ml，采用3倍量乙腈沉淀蛋白，取上清液100?l进样，则要求血浆中环丙沙星浓度在50ng/ml（0.05ng/?l? 1ng/20 ?l）以上，当Cmax在2?g/ml以上时基本可满足生物等效性研究要求 荧光——灵敏度＜0.1ng，能满足本试验要求 2．生物样品预处理方法 初步拟定——采用乙腈沉淀蛋白后取上清液直接进样 ，色谱峰理论板数、对称性下降(前沿峰)，进而导致检测灵敏度降低 经进一步试验确定为： 血浆0.5ml→乙腈1ml沉淀蛋白→二氯甲烷-异丙醇(95:5)5ml萃取→ 60℃氮气流吹干→流动相200?l溶解→20?l进样 3、分析方法验证 （1）方法特异性 （2）标准曲线与线性范围 （3）方法精密度与准确度 （4）方法定量下限 （5）样品的稳定性 5. 样品预处理与分析技术的关系 1.分析方法特点(是否专属、是否具有分离能力) 2.检测系统对杂质污染的耐受程度 决定样品预处理和需要净化的程度 三、生物样品的预处理与制备技术 （一）有机破坏法 应用——微量元素测定 方法 　　　　 1．湿法破坏 2．干法破坏 3．氧瓶燃烧法 1. 湿法破坏 常用试剂—硝酸或硝酸-高氯酸 特点—破坏能力强、反应激烈，无机 金属离子为高价态 应用—适用于血、尿、组织等生物样 品的破坏 缺点—含氮杂环药物的破坏不够完全 注意—切勿蒸干、以免爆炸 样品用量—金属元素量10~100?g，血样 10~15ml、尿样50ml 2、干法破坏 高温炉高温破坏 应用——适合人发样品的破坏 3. 氧瓶燃烧（oxygen flask combustion） 特点——操作简单、快速、设备简单 应用——血浆、人发中卤素、硫、硒等 血浆：血浆1ml分次点于无灰滤纸上 →60℃烘干→按规定折叠后固定 人发：洗净、干燥（60℃ ~ 80℃）→ 剪碎→称取0.1 ~ 0.3g置无灰滤纸中心→按规定折叠固定 （二）去除蛋白质 非破坏性生物样品预处理的第一步 可使结合型药物释放 　　 1.去除蛋白后取上清液直接分析测定 　　2.去除蛋白后取上清液经进一步分离 　　　纯化、浓集后分析测定 去除蛋白质的方法 1. 加入与水混溶的有机溶剂—蛋白质脱水沉淀 2. 加入中性盐—“盐析”沉淀蛋白质 3. 加入强酸—与蛋白质阳离子(铵基) 形成不溶性盐沉淀 4. 加入重金属盐—与蛋白质阴离子 (羧基)形成不溶性盐沉淀 5. 超滤法—半透膜滤除可溶性生物大分子物质(蛋白质) 6. 酶水解法—蛋白分解酶分解蛋白质 7. 加热法—蛋白质变性凝固 1. 加入与水相混溶的有机溶剂　 常用有机溶剂:乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃 　 血样与溶剂体积比—1∶(1~3)可除去90%以上蛋白 　 乙腈—块状絮凝物、易于分离；成分损失 可能性大，上清液pH为8.5~9.5 甲醇—细小颗粒沉淀、不易分离；成分损失可能性小，上清液pH为8.5~9.5 超速离心分离（12000r/min)—离心1~2min 2. 加入中性盐 常用中性盐—饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等 试剂用量—血清与饱和硫酸铵比例为1∶2时除去90%以上的蛋白质分离—高速(12000r/min)离心上清液pH7.0~7.7 3. 加入强酸 常用的强酸——10%三氯醋酸、6%高氯酸、5%偏磷酸等 试剂用量——血清与强酸比例为1∶0.6时，除去90%以上的蛋白质 分离——高速(12000r/min)离心1~2min ，上清液pH 0~4 过量三氯醋酸——