生物技术虚拟实验宋捷2012014069教案.docVIP

西北农林科技大学 磁小体膜蛋白基因的克隆及蛋白纯化模拟 生物技术虚拟实验 宋捷 生物技术122 学号：2012014069 2015/7/4 设计 基因及质粒 在NCBI上检索想要的基因名，限定物种，下载它的核酸序列fasta gb格式，以及蛋白序列 物种名：Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Magnetospirillum. 菌株：Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1 开放阅读框的寻找 使用ORFfinder 寻找该核酸序列的ORF区域，由于该序列已经有完整的已经探索过的CDS区域，故使用CDS区作为之后的目的基因片段 载体和基因的检查 打开vector NTI 建立自己的项目文件 在vector NTI中找到想用的质粒pET-16b，保存。 录入自己的目的基因序列，gb格式 酶切位点的检查 检查常用的酶切位点 在目的片段mms16中有Pst 1 ， Nco 1两个位点 在质粒的酶切位点寻找中剔除这两个位点的识别 结果如图 目的在这个区域的Nde 1 和 BamH 1中进行双酶切插入目的片段 引物设计 该CDS区位于序列的605-1042bp， 上游 ACGG TATACC GGCGGTTCGTCT A是调节退火温度设计的，CGG是保护碱基，TATACC是Nde 1的酶切位点，由于酶切后该酶切位点依旧存留起始密码子，故删掉了序列本身的起始密码子 下游 CCGGCAAGAAGTAA CCTAGG GCG CCTAGG是BamH 1的酶切位点 退火温度差异很小 连接入质粒 因为该启动子是逆时针方向，所以将CDS序列反向互补 然后复制粘贴到质粒的两个酶切位点之间 电泳 将该添加过目的基因的质粒添加到虚拟电泳程序中 使用Maker 使用BamH1 和Nde1两种酶，没有酶加入，和maker 可以看到在双酶切的两条带，上边是切开的质粒（约6000bp），下部分是目的基因片段（约400bp），对照Maker最大8000最小370. 不酶切的质粒略大于酶切的大片段条带，合理。 蛋白质性质预测 等电点预测约为5.59 分子质量约为16215.36（16kd）。 一个较大的疏水区 2.准备策略 购得菌株：Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1 购得表达菌株BL21（ED3） 购得质粒pET-16b 购得BamH1 Ned1 酶 ，连接酶等酶系，Xa因子 将设计的引物送到公司合成 准备Ni亲和层析柱， 准备疏水层析柱 准备阳离子交换柱 准备分子筛 3.培养策略 培养活化MS1菌株 提取其基因组 加入引物，PCR其目的片段（电泳检测） 提取pET-16b质粒 质粒，目的片段双酶切过夜（电泳检测） 连接酶切产物，制备感受态BL21 热激转化感受态菌 活化菌种，平板涂布 菌落pcr，电泳检测 挑菌，小培，扩大（留样） 对数生长期IPTG诱导 细胞浓缩 细胞破碎（高压+超声） 离心得到蛋白粗体物 纯化（电泳数次） 大规模培养纯化 4.纯化策略 疏水层析粗提（电泳） Ni柱层析（电泳） Xa因子处理 阳离子交换柱层析（电泳） 分子筛（电泳） 冻存