腺病毒质量检定方法.docVIP

一、无菌检查 2 （一）薄膜过滤法 3 （二）直接接种法 3 二、支原体检查 4 第一法 细胞培养法 4 第二法 指示细胞培养法（DNA染色法） 5 三、细胞内、外源病毒因子检查 7 1 细胞形态观察及红细胞吸附试验（简称血吸附试验） 7 2 不同细胞传代培养法检测病毒因子 7 3 接种动物和鸡胚法检测病毒因子 8 4 逆转录病毒及其他内源性病毒或病毒核酸的检测 8 1）逆转录酶活性测定 8 2）透射电镜检查 11 3）感染性试验 11 5 特殊外源病毒因子的检测 11 四、致瘤性检查 11 五、感染效率和病毒的产量等的测定 12 六、细胞鉴别（染色体检查） 12 七、病毒敏感性检查 13 八、细胞功能检查 13 九、重组腺病毒滴度的测定 14 十、病毒比滴度（比活性IU）测定 16 十一、E1A区、E2B区、AAV及插入基因的检测 16 一）E1A区的检测 16 二）E2B区的检测 17 三）AAV的检测 18 四）插入基因的检测 18 十二、病毒外源因子检查 19 十三、内毒素测定 19 供试品溶液的制备 19 确定最大有效稀释倍数（MVD） 20 方法1 凝胶法 20 鲎试剂灵敏度复核试验 21 干扰试验 21 检查法 23 十四 效力试验插入基因表达活性测定，插入基因的生物学活性测定 24 十五 复制型病毒（RCA）检测 A549细胞检测法 24 十六 腺相关病毒的检测采用PCR法 26 十七 残留量测定应根据生产工艺及成品的添加成份，对有潜在危险性的成份进行残留量检测： 27 1残余宿主DNA含量测定 27 2残余牛血清白蛋白含量测定 27 3残余核酸酶含量测定 28 十八 重组病毒制品的稳定性试验 28 一、无菌检查 《药典》（2010版第三部）附录ⅫA无菌检查法 ① 试验材料 1、细胞培养上清液 2、硫乙醇酸盐流体培养基 酪胨（胰酶水解） 15.0g 酵母浸出粉 5.0g 葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5g L-胱氨酸 0.5g 新配制的0.1%刃天青溶液 1.0ml 硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸） 0.5g (0.3ml） 琼脂 0.75g 水 1000ml 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调pH值为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调pH值使灭菌后为7.1±0.2。分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2，灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟）后，迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。 3、改良马丁培养基 胨 5.0g 磷酸氢二钾 1.0g 酵母浸出粉 2.0g 硫酸镁 0.5g 葡萄糖 20.0g 水 1000ml 除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调pH值约为6.8，煮沸；加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，灭菌。 4、营养琼脂培养基 琼脂 14.0g 胨 10.0g 氯化钠 5.0g 牛肉浸出粉 3.0g 水1000ml 取上述成分混合，微温溶解，调pH值为弱碱性，煮沸，滤清，调pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。 5、改良马丁琼脂培养基 按改良马丁培养基的处方和制法，加入14.0g琼脂，调pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，灭菌。 6、封闭式薄膜过滤器，滤膜孔径应不大于0.45um，直径约为50mm。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。 ② 试验步骤 （一）薄膜过滤法： 1、将少量的冲洗液过滤，以润湿滤膜。 2、取规定量，每支（瓶）供试品装量为5ml或以下者，全部转移至含适宜稀释液100ml的无菌容器内，混匀，立即过滤；每支（瓶）供试品装量为5ml以上者直接过滤。或全部转移至含适宜稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤。如供试品具有抑菌作用或含防腐剂，须用冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于3次，冲洗量100ml、总冲洗量不超过1000ml。冲洗后，2个滤器中加入硫乙醇酸盐流体培养基各100ml，另一滤器中加入改良马丁培养基100ml。 3、细菌置30-35℃、真菌置20-25℃培养14天，培养期间逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无菌生长，可取该培养基适量转接种同种新鲜培养基中及营养琼脂斜面和改良马丁琼脂斜面培养基上，细菌培养2天，真菌培养3天，观察接种的同种新鲜培