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第九章 工业微生物原生质体育种和原生质体融合育种 原生质体育种 微生物原生质体融合育种 细菌原生质体融合育种 放线菌原生质体融合育种 酵母菌原生质体融合育种 霉菌原生质体融合育种 一、微生物原生质体再生育种 1．原生质体再生育种的一般程序 ： 出发菌株的选择→菌种活化和预培养→原生质体制备→原生质体再生→高产菌株分离（初筛）→复筛→遗传稳定性鉴定→菌种特性及发酵特性研究。 2．原生质体再生育种实例 小单孢菌福堤霉素 二、微生物原生质体诱变育种 （一）原生质体诱变育种方法 1．物理诱变剂诱变原生质体的一般程序： 取10 ml对数生长期微生物培养物，离心收集菌体，无菌水洗涤→离心，菌体沉淀物用酶液悬浮，水解去壁制成原生质体→离心，高渗溶液洗涤原生质体→原生质体悬浮液稀释至一定密度，取适量放入无菌培养皿内→将培养皿移至紫外灯下诱变处理→置暗处后处理一定时间→移入再生培养基中再生培养（由于原生质体较脆弱，用双层平板法再生）→分离优质菌株→突变株稳定性试验→突变株鉴定。 2．化学诱变剂诱变原生质体的一般程序 通常操作程序包括：出发菌株培养和原生质体制备及再生→选择合适的化学诱变剂，配制成合适的浓度→加入原生质体悬浮液，混合（含有高渗溶液，稳定原生质体）→诱变处理→离心弃诱变剂、原生质体沉淀用稳定液洗涤→稀释、分离到再生平板上（双层平板法）→再生培养→观察、筛选突变株→复筛→突变株鉴定。 原生质体诱变周期一般比常规诱变育种要长，难度更大。 三、微生物原生质体转化育种 整条DNA或DNA片段的转化 四、微生物原生质融合育种 五、其他微生物原生质体育种 第二节 微生物原生质体融合育种 用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍—细胞壁，制成由原生质膜包被的裸细胞，然后用物理、化学或生物学方法，诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得具有双亲优良性状于一体的稳定融合子。 聚乙二醇诱导和电融和 聚乙二醇种内融合率可高达27%，种间的融合率也可达10%，比常规的杂交重组频率提高千倍以上。电场诱导融合又将融合率提高10倍。 原生质体融合育种五大步骤： 直接亲本及其遗传标记选择； 双亲本原生质体制备与再生； 亲本原生质体诱导融合； 融合重组体（称为融合子）分离； 遗传特性分析与测定； 二、原生质体制备与再生 （一）原生质体制备 最有效和最常用的是酶法。 原生质体的好坏与培养基成分、培养条件，菌龄和预处理等因素有关。 1、 酶法分离原生质体的影响因素 （1）培养基组成 （2）菌体培养方式：丝状菌常用平板玻璃纸法，细菌和酵母菌多用振荡沉没培养法。 （3）菌体菌龄：丝状真菌以年轻的菌丝用来分离原生质体最佳。尤其是菌丝体尖端细胞。认为对数期的前期和对数期效果最好。 2．原生质体的鉴别 （1）低渗爆破法： （2）荧光染色法：0.05%-0.1%的荧光增白剂（VBL） 3．原生质体的收集和纯化 （1）过滤法：使用砂芯漏斗。 （2）密度梯度离心法： （3）界面法： （4）漂浮法： 4．原生质体的活力鉴定 （1）荧光素双醋酸盐（FDA）染色法 （2）酚藏花红染色法（0.01%染料染色，活红，死白） （3）伊文思篮染色法 （0.25%伊文思篮，活无色，死蓝色） 5．原生质体的保存 （1）立即进行融合或其它方式育种 （2） 5％的二甲亚砜或甘油等其他保护剂；液氮。 （二）原生质体再生 l、原生质体再生的影响因素 ①菌体生理状态 ②稳定剂 ③酶浓度和酶作用时间 ④再生培养基：丝状真菌、酿酒酵母等的原生质体仅能在固体培养基上再生，在液体培养基中细胞壁再生不彻底，不能完全复原。再生培养基要用稳定剂配制，还含有Ca2+和Mg2+,浓度和原生质体形成时的酶解液相类似，菌种不同稍有差别。 ⑤残存菌体的分离 ⑥原生质体密度 ⑦排除再生培养基上的冷凝水， ⑧再生方法， 2．再生率及其计算 再生频率=（再生培养基上的总菌落数-酶处理后未原生质化菌落数）/原生质体数×100% 细菌原生质体再生频率在90％以上， 放线菌的50～60％， 真菌为20－70％。 三、原生质体融合 （一）原生质体融合过程 两亲株原生质体混合于高渗透压的稳定液中，在PEG的诱导下，两个或两个以上凝聚成团，相邻原生质体紧密接触的质膜面扩大，相互接触的质膜消失，细胞质融合，形成一个异核体细胞，异核体的细胞在繁殖过程中发生核的融合，形成杂合二倍体，通过染色体交换，产生各种重组体，称为融合子 （二）原生质体融合的影响因素 1．融合剂： 化学融合剂：