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第二章 生物固氮 生物固氮是生命科学的重大基础研究课题之一， 在农业生产中发挥重要作用。 生物固氮是指空气中的分子氮通过固氮微生物的作用转化为植物可直接利用的氨的过程。 生物固氮是地球上最大规模的天然氮肥工厂，全球每年生物固定的氮量多大2亿吨（相当于4亿吨尿素，FAO1995年估计），占全球植物需氮量的75%。 没有生物固氮，就没有地球上的植物和动物。 2.1 固氮微生物 固氮微生物是指通过固氮酶的催化将空气中分子氮还原为含氮化物的微生物。 固氮微生物种类很多，分为三大类群： 自生固氮微生物 联合固氮微生物 共生固氮微生物。 2.2 固氮酶及固氮反应 固氮酶所催化的反应： 8e- N2+8H++32ATP------2NH3+H2+32ADP+32Pi 这个反应包括两个组分： 组分I由两个5.0×104的α亚基和两个6.0×104的β亚基组成， 由nifD和nifK基因编码， 含有4个[4Fe-4S]连接桥，两个铁-钼辅助因子（FeMoCo）； 常被称为铁钼蛋白（FeMo-protein）。 组分II由两个完全相同的相对分子质量各为3.0×104的亚基所组成， 由nifH基因编码，常被称为铁蛋白（Fe-protein）。 只有一个[4Fe-4S]连接桥，位于两个亚基之间， 一次只可送出一个电子，是生物固氮反应中的“瓶颈”。 2.3 固氮基因调控 nifAL基因控制了整个固氮酶系统的表达和活性。 若nifA基因突变，那么固氮酶和其他所有已知的nif基因产物都会消失。 若再将野生型nifA基因导入上述突变株中，nif操纵子的功能就得到恢复。 nifA和nifL基因产物分别是nif操纵子的正、负调控因子。 当细胞内没有nifL蛋白质时，nifA基因产物足以激活其他nif基因的表达。 带有突变型nifAL基因的菌株UNF714 ，其固氮酶活性为零。若将带有nifA质粒正向表达载体pMC73A导入UNF714中，不但能完全恢复野生型固氮酶活性，而且在10mmol/L NH4+中仍有15%～30%的活性。 nifA基因只有在氮调控基因—ntrA、ntrC基因产物的共同作用下才能正常工作，激活nif 操纵子； 而ntrC基因的活性是直接受NH3影响的， NH3浓度较高时，ntrC基因产物没有转录活性。 细胞质内谷氨酰胺：α-酮戊二酸的比值较低时，UMP就在glnD基因产物的作用下被转移到GlnB蛋白上；反之则从GlnB蛋白上脱去UMP。不带有UMP的GlnB蛋白能与NtrB产物相结合并导致NtrC基因产物去磷酸化，丧失启动nifAL基因转录的功能。 当细胞内游离NH3含量较低时，GlnB蛋白被尿苷化并与NtrB蛋白分离，使NtrB蛋白激酶的功能得到发挥，将NtrC蛋白磷酸化而激活nif操纵子系统。 细胞内氧浓度一般都在数百微摩尔左右，而固氮酶只能在几十纳摩尔O2浓度下才能正常工作， 固氮菌依靠Lb解决了这对矛盾，因为Lb对O2有极高的亲和力，它与大量自由O2相结合，既大大降低了自由O2浓度，又能将分子氧直接输送到呼吸链。 2.4 共生固氮菌—根瘤菌研究 2.4.1 根瘤菌分类 在分类上属于根瘤菌科（Rhizobiaceae）,包括7个属36种： 根瘤菌属（Rhizobium）： 菜豆根瘤菌（R.phaseoli）等12个种。 慢生根瘤菌属（ Bradyrhizobium）：大豆慢生根瘤菌（B.japonicum)等4种。 中华根瘤菌属（Sinorhizobium）： 苜蓿中华根瘤菌（S.meliloti)等9种。 中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium）：华葵中慢生根瘤菌（M.huakuii)等8种。 固氮根瘤菌属（Azorhizobium）： 天菁固氮根瘤菌（A.cuulinodan)等1种。 土壤杆菌属（Agrobacterium): 根癌土壤杆菌（A.tumefaciens）等1种。 叶瘤菌属（Phyllorhizobium）： 紫金叶瘤菌属（P.myrsinacearum)等1种。 它们能浸染豆科植物形成独特的共生结构-根瘤或茎瘤。 2.4.2 根瘤形成的一般生物学过程 根瘤菌-豆科植物共生相互作用具有专一性，即每种根瘤菌（或