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丝状真菌中获得重组蛋白——我们是否期待太多？ Making recombinant proteins in filamentous fungi- are we expecting too much? Helena Nevalainen* and Robyn Peterson 文献来源：frontiers in MICROBIOLOGY 2014，5（75）：1-10 摘要 用于重组蛋白生产的宿主是为特殊目的选择的典型高蛋白分泌突变菌株，例如纤维素降解酶的高效生产。然而，令人吃惊的是，对被广泛应用于重组基因表达的宿主，对水解纤维素的里氏木霉的一系列突变菌株进行基因组测序，结果几乎没有阐明促进高水平蛋白分泌方面性质的改变。虽然普遍认为和表明，丝状真菌的蛋白分泌主要发生在菌丝末梢顶端，越来越多的证据显示蛋白分泌同样可以发生在接近顶点的区域。利用细胞分子伴侣和折叠酶的共表达来尝试促进正确折叠以增加异源蛋白的产量已经获得很多成功；转录水平上的潜在原因已经被主要研究。真菌菌株中所观察到生理变化，即通过强启动子过表达蛋白带来压力增加，同样反映了宿主所面临的挑战。很明显，和其它真核生物一样，真菌内质网是一个高度动态结构。综合考虑，研究利用较弱表达启动子来阻止过度压力是一种新兴工作。丝状真菌被认为是用于生产治疗用途药学蛋白的候选者。就真菌生产异源基因产物而言，其中一个最大的挑战是它们的糖基化模式；真菌缺少哺乳动物中发生的功能重要的聚糖末端唾液酸化作用。最后，共同研究复杂的发酵工艺以及代谢路径和通量或许可以得出新的策略来在丝状真菌中生产重组蛋白。 关键词：丝状真菌，重组蛋白，表达，分泌，里氏木霉 前言 作为自然界顽固聚合物的腐食生物，丝状真菌，例如水解纤维素的里氏木霉，被认为是生长菌丝外蛋白的优秀分泌者。多年来，这个特性已经被提高到工业生产菌株能够在优化发酵条件下分泌100g/L同源蛋白到培养基中的程度（Cherry and Fidantsef,2003）。因为这些水平远好于其他生物，丝状真菌有希望是工业规模重组蛋白的最大生产菌株。朝着这个目的，目前进行内部蛋白质量控制，分泌压力，蛋白表达和分泌相关的基因组学，翻译后蛋白的修饰，选择性表达启动子的应用，特别转录因子的识别以及真菌生理机制和生产力的联系这些方面细胞机制上的研究（reviewed in Punt et al., 2002; Meyer, 2008; Lubertozzi and Keasling, 2009; Sharma et al., 2009; Fleissner and Dersch, 2010; Schuster and Schmoll, 2010; Ward, 2012）。分子方法，例如密码子优化以及融合一个同源高分泌蛋白来表达外源蛋白，已经成为真菌实验室的常规方法（(Conesa et al., 2001; Nevalainen et al., 2004）。 除了产量，异源蛋白以活性/功能形式产生同样重要。丝状真菌分泌的蛋白在分泌途径中由折叠、蛋白水解、添加多糖基团进行修饰，其中添加多糖基团是主要的修饰方式。关于在丝状真菌中生产起源于哺乳类生物的有功能重组蛋白，最关键的修饰可能是糖基化，因为其可能影响蛋白的功能、血清半衰期和免疫原性。丝状真菌中糖基化的主要模式是高甘露糖类型，添加的糖并没有哺乳动物细胞中发生的并且功能重要的多糖糖链末端唾液酸化特征（Brooks, 2004; Deshpandeet al., 2008; De Pourcq et al., 2010）。这一领域的潜在发展将在下面讨论。 实验证据表明，由于不正确过程、修饰或错误折叠导致其在细胞质量控制机制中被除去，丝状真菌表达的外源蛋白丢失或困在分泌路径中（(Archer and Peberdy, 1997; Gouka et al., 1997）。这些机制的遗传学、转录组学和蛋白组学研究揭示了这个过程中的一些基因和调节循环（Chapman etal., 1998; Pakula etal., 2003; Al-Sheikh etal., 2004）。这个知识促生了一系列文献，其中包括在黑曲霉中和感兴趣的蛋白一起过表达编码细胞折叠酶和分子伴侣的基因（see Nevalainen etal., 2004）。这个结果在“没有影响”（例如，和牛凝乳酶共表达的prpA；Wang and Ward, 2000）到和植物甜蛋白共表达的pdiA产量提高五倍间发生变化（Moralejo et al., 2000）。已经发表的例子太少以至于不能得到更广泛的结论，但是其表明在丝状真菌中异源真菌蛋白的产量比源于哺乳类的蛋白有更好的机会得到提高；这在没有分