QC-FF-0039微生物限度检查法标准操作规程..doc

目的：建立微生物限度检查法标准操作规程 范围：本规范适用于微生物限度检查法检查 内容： 第一部分：综述 1.简述 细菌、霉菌和酵母菌计数是检测非规定灭菌制剂及原、辅料受微生物污染程度的方法。也是评价生产企业的药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、环境和操作者卫生状况的重要手段和依据。细菌、霉菌和酵母菌计数除另有规定外均采用平板菌落计数法，这是活菌计数的方法之一，也是目前国际上常用的一种方法。以琼脂平板上的细菌、霉菌或酵母菌形成的一个独立可见的菌落为计数依据。该法测定结果只反映在规定条件下所生长的细菌（嗜中温、需氧和兼性厌氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落数，不包括对营养、氧气、温度、PH和其他因素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。一个细菌、霉菌或酵母菌的菌落均可由一个或多个菌细胞生长繁殖而成。因此供试品中所测得的菌落数，实际为菌落形成单位数，不应理解为细菌、霉菌、酵母菌的个数。 在进行本法测定时，必须严格按本法所规定的条件操作，以免产生实验误差。 2.设备与仪器 2.1设备 2.1.1无菌室 微生物限度检查应有单独的无菌室，每个无菌室应有独立的净化空气系统。 2.1.1.1结构和要求见中国药典二部无菌检查法 2.1.1.2操作间 操作间应安装空气除菌过滤层流装置。环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压，不低于4.9Pa。操作台上备有电子天平，乙醇灯，火柴，乙醇棉球，大、小橡皮乳头等。 2.1.1.3缓冲间 缓冲间内应有洗手盆，无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。缓冲间内不得放置培养箱和其他杂物。 2.1.1.4洁净级别及检查方法 通常采用尘粒数及浮游菌数或沉降菌数测定法（参照《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌、和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。 沉降菌数测定（ 法）无菌室操作台消毒擦拭后，先启动层流净化装置30min，将备妥的营养琼脂平板3个（经30-35℃预培养48h，证明无菌落生长），以无菌方式（或经传递箱）移入操作间，置净化台左、中、右各1个，开盖，暴露30min后将盖盖上。在30-35℃培养箱内，倒置培养48h,取出检查。 3个平板生长的平均菌落数不超过1个。 2.1.1.5在每次操作前、后，用0.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒液擦拭操作台及可能污染的死角。然后启动层流净化装置，同时用紫外杀菌灯照射30min。 2.1.2阳性菌试验应另设单独的净化工作台，不得在供试品检验用的无菌室内或净化工作台上操作。 2.1.3无菌室与洗刷、灭菌消毒、培养、结果观察及办公间等配套设施应相对集中，布局合理，避免污染，便于管理。 2.2仪器 2.2.1恒温培养箱（30-35℃）、生化培养箱（20-25℃）、微波炉、匀浆仪（3000-8000r/min）或康氏振荡器、恒温水浴、电热干燥箱（250-300℃）、电冰箱、离心机、离心管、0.45μm滤膜及薄膜过滤器、蒸汽灭菌器（使用时要进行生物指示剂灭菌效果检查并应定期请有关部门检定）。菌落计数器、显微镜（1500x）、电子天平或天平（感量0.1g）， 系列比色计。 2.2.2玻璃器皿锥形瓶（250-300ml,，内装玻璃珠若干；500ml，1000ml）、培养皿(直径9cm）、量筒（100ml，500ml）、试管（18mm×18mm、28mm×198mm ）及塞、吸管(1ml分度0.01，10ml分度0.1）、注射器（20ml或30ml等）、注射针头、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）、不锈钢桶（带盖）。玻璃器皿用前应洗涤干净，吸管、量筒不挂水滴，无残留抗菌物质。吸管口上端距处塞入约2cm适宜疏松的棉花，置吸管筒内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应加硅胶塞或棉塞，若用振荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞，以免振荡时供试液污染瓶塞，再用牛皮纸包扎。玻璃器皿，均于高压蒸汽121℃灭菌30min，烘干或160℃干热灭菌2h，备用。 2.2.3用具大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用70%-75%乙醇溶液浸泡）。无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。接种环（白铱金或镍铬合金，环径4-5mm、长度6-10cm）、乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌钢锥、灭菌称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓦盖（12cm）、实验记录纸等。 3.试液、稀释剂和试剂 3.1试液 3.1.1 0.1%苯扎溴铵溶液或其它适宜消毒液（供洗手、擦拭操作台面用）。 3.1.2 5%石碳酸溶液或其他适宜消毒液（配好后装入玻璃消毒缸内，供消毒带菌 吸管用）。 3.1.3 75%乙醇溶液。 3.1.4 碘酊或碘伏溶液