第三植物细胞工程的基本原理和技术基础.pptVIP

生长素类：在组培中用于诱导细胞的分裂和根的分化。常用的有IAA(吲哆乙酸)、NAA (奈乙酸 )、2,4-D(二氯苯氧乙酸)和IBA(吲哆丁酸)等。溶于95%的酒精或0.1mol/LNaOH溶解，常用量0.05-5mg/L 细胞分裂素类 ：促进细胞分裂和诱导芽的分化。 常用的有KT (激动素)、6-BA(6-卞基腺嘌呤)、玉米素等。 溶于0.5-1mol/LHCl溶解或稀薄的NaOH,常用量0.05-10mg/L 植物组培常用激素及其作用 一般情况下 生长素浓度约等于细胞分裂速浓度 愈伤组织生长 生长素浓度大于细胞分裂速浓度 促进生根 生长素浓度小于细胞分裂速浓度 促进生芽 6、琼脂 一种海藻多糖累物质，并非一种必需成分，一般使用浓度0.7%~1%。 作用：凝固培养基，支撑培养材料。 其他附加物： Vc、活性炭、PVP、抗坏血酸等 作用，防止愈伤组织褐化，活性炭吸收代谢的有毒物质等。 二、常用培养基类型 MS和B5培养基 MS培养基是1962年Murashige和Skoog发明的。 B5培养基 MS培养基成分组成 培养基的配制 市售粉末直接溶解或者如MS培养基，用储备液稀释后混合 然后加入3％的蔗糖，加入琼脂，溶解定容, 调节PH约5.8,分装入各瓶，牛皮纸封口，121 ℃，高压灭菌约15分钟。 加热易分解的激素等要无菌水配制，过虑除菌，然后与灭菌过的培养基混合。例如GA3、IAA、ABA、玉米素加热易分解。 思考：选择培养基时激素的浓度怎样确定？ 正交实验 NAA umol/l BAP(umol/l) 0 0.5 2.5 5 10 0 0.5 2.5 5 10 （三）、培养条件 PH值 一般5.5~6.0 温度，一般24 ℃ ～28 ℃ 光照，光强 湿度 一般80％ 1、培养基的物理性质 固体、液体培养的选择；培养基中琼脂的量很重要。 2、光照 包括光照时间，光质，光强等，愈伤组织的形成虽然不需要光照提供能量，但光照对其是一种诱导效应。 3.温度、湿度及气体 温度过高或过低对器官发生的数量和质量均有影响，一般24 ℃ ～28 ℃ 4、培养基的pH一般5.5~6.0。培养基的 pH可通过影响培养物的营养吸收、呼吸代谢、DNA合成，生长调节物质进出细胞等直接或间接的影响愈伤组织的形成及器官再生。 第三节、植物组织培养的基本过程 （一）培养基的选择与配制 （二）材料采集与消毒 （三）制备外植体 （四）接种 （五）培养 材料采集 组织培养所用的材料非常广泛，可采取根、茎、叶、花、芽和种子的子叶，有时也利用花粉粒和花药，其中根尖不易灭菌，一般很少采用。 材料的消毒 （1）先将材料用流水冲洗干净，最后一遍用蒸馏水冲洗，再用无菌纱布或吸水纸将材料上的水分吸干，并用消毒刀片切成小块。 （2）在无菌坏境中将材料放入70％洒精中浸泡30－60秒。 （3）再将材料移入漂白粉的饱和液或0.1％升汞水中消毒约10分钟。 （4）取出后用无菌水冲洗4-5次。 常用的灭菌药物、种类、浓度及效果 外植体用消毒剂消毒后，为什么要用无菌水漂洗？ 有时候会在消毒溶液中加入1～2滴的表面活性物质，例如吐温80或吐温20，为什么？ 消毒剂主要是用来对外植体消毒的，使用后外植体表 面会有残留，若不用无菌水冲洗，会严重组织和细胞， 影响外植体体外培养，另外，外植体已是消毒过的， 若不用无菌水冲洗而用蒸馏水的话，会使得外植体再次染菌。 表面活性物质可以是外植体表面湿润，也可以使外植体与 消毒液充分接触，另外，表面活性剂可以除去外植体表面 的脂溶性物质，使得消毒剂更好发挥消毒作用。 制备外植体  将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，叶片则不需剥皮。然后切成0.2－0.5厘米厚的小片，这就是外植体。在操作中严禁用手触动材料。 接种 将经过消毒，灭菌过的活的外植体，按照不同的要求移植到培养基上培养的过程。 接种过程要严格按照无菌操作，预防污染 外植体的培养 1、固体培养 最常用的方式，一般使用凝固剂琼脂（浓度0.7%~1%） 2、液体培养 分为静止培养和振荡培养 3、饲养培养 指用处理过的无活性的或分裂很慢的、不具备分裂代谢能力的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长。 4、看护培养 指 一块活跃的愈伤组织来看护单个细胞，使其分裂和增值的一种培养方法。 5、微室培养 为单细胞活体连续观察 而建立的单细胞培养技术， 可对单细胞的生长和分化， 细胞分裂的全过程及胞质 环流的规律等进行活体 连续观察。 1、内在因素 外植体的遗传性状 裸子植物、蕨类植物、苔藓植物诱导愈伤组织很难，被子植物较容易 双子