生理学実習実験5白血球の形態と機能.pptVIP

生理学実習実験５：白血球の形態と機能 担当：D班（41046～41060） 発表：高橋（岳）、田宮、遠山 目的 比重の違いを用い白血球を２群に分ける それぞれの白血球の全体に占める割合を調べ、形態を観察する 好中球の遊走能を調べる 　 方法 １．末梢血液の採取 ２．赤血球の沈降?除去 ３．白血球の分画採取 ４．標本作成（全血；中間層、ペレット） ５．形態観察 １．末梢血液の採取 肘静脈から21mlの血液を採取する 　―1mlは全血白血球の計測に用いる 　―残りは分画標本の作成に用いる 凝固防止のためヘパリンを十分混和する（注射筒の壁にも塗ってある） ２．赤血球の沈降?除去 多糖類であるデキストランを混和する ―赤血球をからめとることで、効率よく沈降させられる ２．赤血球の沈降?除去 ３．白血球の分画採取 Ficoll-Paque液を加えて遠心分離する ３．白血球の分画採取 ３．白血球の分画採取 ３．白血球の分画採取 ３．白血球の分画採取 遠心分離の後、中間層?ペレットを抽出し、各分画を洗浄する 　―中間層分画は遠心を１回行う 　―ペレット分画は一度低張液（0.2％NaCl）を加えて赤血球を溶血させて遠心し、再度洗浄?遠心を行う ４．標本作成　　（全血；中間層?ペレット） 計数のための標本 全血：Turk液（低張液）による染色 　　　―余計な赤血球を除く 分画：Trypan blueによる染色 　　　―生きている細胞と死んだ細胞とを見分け 　　　　　るために加える ＜結果＞白血球の数（/mm3） ５．形態観察 形態観察のための標本 May-Giemsa染色を施した後、顕微鏡による観察 ５．形態観察―全血 直径10～15μm 桿状または２～５分葉の核 細胞質は淡いピンク色 多数の顆粒 ５．形態観察―全血 直径10～15μm ２～３分葉の核 大きさのそろった赤紫色の顆粒が細胞質全体に広がる ５．形態観察―全血 直径10～15μm ２～３分葉核（不定形） 細胞質はやや紫がかったピンク色 顆粒 ５．形態観察―全血 直径7～15μm 球形の核 細胞質は薄い青色 細胞質が少ない リンパ球の隣は血小板 ５．形態観察―全血 直径12～20μm 不定形（馬蹄形など）の核 細胞質は青色 空胞がある ５．形態観察―中間層 ５．形態観察―ペレット ＜結果＞①各白血球の割合（％） ＜結果＞①各白血球の割合（％） ＜結果＞①各白血球の割合 白血球の主な成分はリンパ球と好中球である 中間層ではリンパ球が殆どを占める ペレットでは好中球が大部分を占める ＜結果＞②白血球の回収率 中間層：25.3％、7.45％ ペレット：61.2％、74.7％ →回収率はあまり良くはない 考えられる理由 　―赤血球を沈降させるときに一緒に失われる 　―数回の洗浄 　―（特に中間層で） 　　　抽出しにくい?リンパ球が壊れやすい ＜結果＞③分画効率 中間層：99％、96％ ペレット：99％、98％ 　→概ね分画はうまくなされている 　　　若干のコンタミネーションはある 実験２ 白血球の遊走能の測定 実験の目的 目的白血球を分画して得られた好中球がメインの細胞浮遊液を用いて、好中球の遊走を観察する。走化性物質と阻害剤を加えて遊走能を定量し、そのメカニズムを理解する。 結果の予測 予測１．走化性物質の濃度が高いほど遊走能 は高くなる。２．阻害剤を入れると遊走は止まるかとて も遅くなる。 操作手順 　１．アガロースプレートの作成 　２．ｆMLP溶液の希釈 　３．好中球遊走の観察 アガロースプレートの作成 材料１．MEM（Minimum Essential Medium）２．牛胎児血清???細胞の栄養３．NaHCO3???インキュベーターでのCO2 　との緩衝液 アガロースプレートの作成 穴あけ 操作手順 　１．アガロースプレートの作成 　２．ｆMLP溶液の希釈 　３．好中球遊走の観察 好中球遊走の観察手順 （好中球を含む）細胞浮遊液を二群に分け、一方はcytochalasinBを加え、一方は対照群としてDMSOを加える。 それぞれの群で、各濃度のfMLPと細胞浮遊液を右図のようにウェルに分注していく。 二時間CO2存在下で培養。 外、内への遊走距離を測定し、その差（外－内）を取る。それぞれをグラフ化する。 内側：対照液　外側：fMLP　中:細胞浮遊液 観察の実際 前半班の遊走距離 考察１：なぜある濃度以上では移動距離が減少するのか？ 前半班の遊走距離 考察２：なぜ内側にもある程度の距離を動くのか 遊走には二種類ある１．方向性を持った遊走→主に外側への遊走２．ランダムな遊走→内側へ動いた距離分、同心円状に動く 遊走範囲の概形 前半班の遊走距離