細胞实验课讲义.docVIP

实验一 实验前准备（4学时） 组织细胞培养技术要求无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。 一 目的及要求 了解细胞培养实验室的设置和设备，掌握培养用品的清洗和消毒灭菌。 二 细胞培养实验室的设置及设备 1．细胞培养实验室的设置 ⑴ 无菌操作区：无菌操作室，净化工作台，无菌操作箱 ⑵ 孵育区 ⑶ 制备区 ⑷ 储藏区 ⑸ 清洗和消毒灭菌区 2．细胞培养实验室的设备 ⑴ 仪器： ① 显微镜 ② 培养箱 ③ 干燥箱 ④ 水纯化装置 ⑤ 冰箱 ⑥ 细胞冻存储存器 ⑦ 离心机及天平 ⑧ 消毒器 ⑨ 滤器 ⑵ 培养用器皿 ①培养器皿：培养瓶 培养皿 多孔培养板 ②培养操作有关的器皿：储液瓶 吸管 加样器 ⑶ 器械 三 培养用品的清洗和消毒灭菌 1 目的：去除器皿上杂质及其对细胞生长有影响的物质及各种微生物。 2 步骤 2.1 培养用品的清洗 （1）清洗：实验后必须及时，彻底清洗，不同的器皿清洗方法和程序不同，应进行分别，分类处理。 ① 玻璃器皿：用于培养细胞,细胞冻存，培养用液的存放等。 A目的：玻璃表面清洗干净，无油迹，不残存任何毒性物质，而且带适当的电荷（苛性碱清洗剂使细胞表面带的电荷不适于细胞附着，需以HCL或H2SO4中和。） B 步骤：a刷洗:毛刷和洗涤剂（不宜用力过猛），注意瓶角等部位的洗涤。洗刷后将洗涤剂冲洗干净，晾干。b 清洁液浸泡：清洁液（由浓硫酸 ，重铬酸钾及蒸馏水配置而成）浸泡过夜，或至少为6h以上。c 冲洗：流水彻底冲洗，每个器皿用流水灌满，倒掉，重复10次以上→蒸馏水漂洗2-3次→三蒸水漂洗一次→烤箱烘干备用。 ② 胶塞、盖子等 步骤：（不能用清洁液浸泡）新胶塞先自来水冲洗，再进行常规清洗。用过的胶塞、盖子及时浸泡清水中，用洗涤剂刷洗。针头用洗涤剂洗涤干净→1%稀盐酸浸泡30min，冲洗→蒸馏水漂洗2-3次→三蒸水漂洗1次→晾干 ⑵ 包装：消毒前进行包装。 A目的：便于消毒及储存，防止落入灰尘即消毒后再次污染。 B步骤：皱纹包装纸、硫酸纸、牛皮纸、棉布等作为包装材料，对培养瓶、滤器、存放培养瓶用储液瓶、吸管、胶塞和盖子等物品的容器瓶口部分做局部包装密封，再用牛皮纸、玻璃纸或布包起来备用。培养皿、移液器吸头可以全封闭包装。注射器、金属器械可直接装入铝制饭盒等。 2.2 培养用品的消毒灭菌 ⑴ 消毒灭菌的方法（物理方法和化学方法） ① 干热消毒：主要用于消毒玻璃器皿。一般在烤箱中进行，160℃，90-120min。 ② 湿热消毒：一般使用高压蒸汽灭菌器进行消毒。加热升压之前，打开排气阀门，使加热后消毒器内的残留冷气排出。消毒完毕后先打开阀门放气，再打开消毒器的盖。 ③ 紫外线消毒：主要用于实验室房间里的空气、操作台表面及桌椅等消毒。 ④ 过滤消毒：用于组织细胞培养使用的液体。 ⑤ 消毒剂及抗菌素 用于操作人员皮肤、实验台、器械、器皿的操作表面，实验室的椅、桌、地及空气的处理。主要有75%酒精、过氧乙酸等。 ⑵ 消毒方法的选择 ① 实验室环境的消毒：紫外线消毒。实验室地面消毒：新洁尔灭溶液。 ② 培养器械的消毒：多数采用干热或湿热消毒。 ③ 培养用液体的消毒：过滤。 ④ 净化工作台的消毒：紫外灯照射30-50min灭菌，用75％酒精擦洗台面，关闭灭菌灯后应启动风机运转2min后再进行培养操作。 实验二 光学显微镜的原理和应用（4学时） 在科研工作中，显微镜是必不可少的基本工具之一，特别是在细胞生物学、组织病理学等学科中发挥了极其重要的作用。本章重点介绍两种常用的显微镜：倒置相差显微镜、荧光显微镜 一 目的要求 1 掌握倒置相差显微镜的原理、用途和使用方法。 2 熟悉荧光显微镜的原理、用途和使用方法。 二 倒置相差显微镜 1 实验原理 波长、频率、振幅、相位是所有波的四种基本属性。在人的视觉中，可见光波的波长(及频率)的变化，表现为颜色的不同，振幅变化表现为明暗的不同，而相位变化肉眼是感觉不到的。当光通过透明的活细胞时，虽然细胞内部结构厚度不同，但波长和振幅几乎没有改变，只是相位有了差别，所以用普通的光学显微镜无法看清未经染色的活细胞的内部细节。 相差显微镜(phase contrast microscope)利用光的衍射和干涉特性，在普通光学显微镜中增加了二个部件：在聚光镜上加了一个环状光阑，在物镜的后焦面加了一个相板，从而使看不到的相位差变成以明暗表示的振幅差。因此，可以用来观察无色透明活细胞中的细节。 倒置显微镜(inverted microscope)的光学原理与普通光学显微镜原理基本相同，它们之间主要差别是倒置显微镜的光源安装在标本的上方，物镜装在标本的下方，因此，可以用来观察生长在培养瓶皿底部的细胞状态。它与相差装置配合，用来观察培养