細胞生物学自主实验.docVIP

人体外周血淋巴细胞培养与染色体组型分析实验方案 一、实验背景（具体背景请组员自己查，以下仅供参考） 人类染色体组型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体在技术的基础上按照染色体的大小和形态特征，主要根据着丝点位置对染色体进行分组、排队和配对。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。通过对人类染色体组型进行分析可以初步学会对染色体进行分析的方法。 二、实验目的 掌握人体外周血淋巴细胞培养方法与人类染色体组型分析的方法 三、实验原理（理论基础，供参考） 1.细胞培养是在体外模拟体内的生理环境培养从机体中取出的细胞并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。要使细胞能在体外长期生长必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度、注意外环境酸碱度和渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 2.染色体是组成细胞核的基本物质,是基因的载体。人类细胞遗传学研究的主要对象是染色体。本实验采用了微量全血培养技术，既方便又节省人力物力。在正常情况下,人外周血中是没有分裂相的,只有在异常情况下才能发现。 植物血细胞凝集素(PHA)是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂,在PHA作用下,原处于G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞,进而进行有丝分裂。利用PHA这一特性, 淋巴细胞经过含有PHA培养液培养,在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体,终止分裂中期的淋巴细胞,经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定就可获得大量的中期有丝分裂细胞。最后经空气干燥法制片，便可得到质量较好的染色体标本，即可得到所需的人体染色体图形。 3.染色体组型又称核型,是指将动物、植物、真菌等的某一个体或某一分类群亚种、种、属等的体细胞内的整套染色体按它们相对恒定的特征排列起来的图像。核型模式图是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来，再按长短、形态等特征排列起来的图像。染色体组型分析就是通过对染色体标本和其照片进行测量、对比分析、配对、分组、排列对各染色体的形态进行分析。在细胞遗传学、现代分类学、生物进化和遗传育种学等研究中是重要的研究手段。对于任何一个染色体的基本形态特征来说重要的参数有以下3个: 1．相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X或Y染色体)的总长度×100% 2．臂指数=长臂/短臂 反映着丝粒位置的指数  3．着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%反映着丝粒位置的指数 三、实验仪器试剂及材料 1、材料:人的静脉外周血。组内选取男女各一名取血样。 2、试剂：RPMIl640培养基（完全培养基）、浓度为10mg/ml的PHA（植物血球凝集素）、0.1mg/ml秋水仙素溶液、Giemsa染液、低渗溶液（用KCl配制）、NaHCO3（配细胞培养完全培养基时用于调PH）、Carnoy固定液（9ml纯酒精+3ml冰乙酸）等。 3、器材：恒温培养箱、恒温水浴箱、离心机、分析天平、显微镜、超净工作台、移液管、离心管、培养瓶、试管架及试管、镊子、量桶、烧杯、酒精灯、染缸、染色架、胶头滴管等。 四、实验方法 一、各种试剂及培养基的配制方法（供实验中分析与参考，若实验室已提供就不再配制） (1)RPMI-1640基础培养基的配制称取RPMI-l640培养粉9.8g溶于1000mL蒸馏水中,经G6型号细菌过滤漏斗中0.45微米与0.22微米的滤膜抽滤后备用。使用前最好做热源培养以确保实验顺利进行。(老师提供) (2)5%NaHCO3的配制称取5gNaHCO3,溶于100mL蒸馏水中,高压灭菌备用。 (3)生理盐水的配制称取0.85gNaCl溶l00mL蒸馏水中高压灭菌备用。 (4)PHA(植物血球凝集素)的配制称取PHA50mg配制成浓度为lmg/mL(生理盐水配制)的溶液。由于PHA使用量较少,配制时使用注射器式无菌过滤器,以减少药品损失。（老师提供，浓度为10mg/ml） (5)肝素溶液的配制40ml生理盐水溶解粉末160mg（每mg含126单位）配制成500单位/ml，8磅15min灭菌。（不用配，医院提供） (6)双抗溶液的配制将青链霉素用生理盐水按效价单位配成l0万单位/mL,配制过程要求使用注射器式无菌过滤器. (7)秋水仙素溶液的配制用生理盐水配制成浓度为40微克/mL秋水仙素溶液,使用注射器式无菌过滤器进行除菌操作。（老师提供，浓度为0.1mg/ml） (8)低渗液溶液的配制称取5.59gKCl溶于1,000mL双蒸馏水中,配制成溶液浓度为0.075mol/L的低渗液溶液。（该溶液自己配） (9)细胞培养完全培养基的配制在每个培养瓶中加入RPMIl640基础培养基2mL,小牛