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2.5.2 菌株初步判定 通过对分离菌株进行菌落和菌体特征观察、革兰氏染色试验和过氧化氢酶试验对分离菌株做初步判定。 （1）革兰氏染色试验： 涂片干燥 固定草酸铵结晶紫初染媒染水洗95%乙醇脱色沙黄复染水洗干燥紫色革兰氏阳性菌，红色革兰氏阴性菌 将筛选出的两株代表菌株分别接种到乳酸菌生长培养基中（见2.2.3），在37℃的恒温培养箱内培养0h、7h、14h、21h、28h、35h、42h和49h后，分别在室温下用精密酸度计直接测定菌液的pH值，然后绘制两株菌的产酸曲线。 2.5.4 代表菌株的生长状况（活菌数变化） 将筛选出的两株代表菌株分别接种到乳酸菌生长培养基中（见2.2.3），在37℃的恒温培养箱内培养0h、7h、14h、21h、28h、35h、42h和49h后，分别测定其培养菌液的OD值，（原菌液用无菌生理盐水稀释10倍，以稀释10倍培养后的空白培养基作为对照）然后绘制曲线。 2.5.5.代表菌株的耐糖性 将分离菌株L-1和S-5按2%的接种量分别接种到葡萄糖浓度为5%、10%、15%、20%、25%、 30%和35%的MRS液体培养基中，在37℃恒温培养箱中培养24h，然后观察试管内菌液的浑浊程度。 2.5.6发酵类型 将分离得到的10株菌接种到经121℃、15min高温灭菌的 MRS半固体培养基（MRS液体培养基中加0.6%的琼脂）中，待培养基凝固再加入1mL经灭菌的琼脂封口 ，在37℃恒温培养箱中培养24h，然后观察是否产生气体，不产生气体为同型发酵，产生气体为异型发酵。 1、菌种培养：取大肠杆菌斜面菌种1支，以无菌操作挑取1环菌苔，接入肉膏蛋白胨培养液（LB）中，静止培养12--14h，备用。 2、制备LB培养基100ml置于200ml三角瓶内，备用。? 3、标记：取11支无菌大试管，用记号笔分别标明培养时间，即0、1.5、3、4、6、8、10、 12、14、16和20h。? 4、接种：分别用5ml无菌吸管吸取5ml大肠杆菌培养液(培养12~14h)转入盛有100ml??LB液的三角瓶内，混合均匀后分别取5ml混合液放入上述标记的11支无菌大试管中。 ?5、培养：将已接种的试管置摇床37℃振荡培养(振荡频率250r/min)，分别培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，将标有相应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存，最后一同比浊测定其光密度值。 6、比浊测定：用未接种的LB液体培养基作空白对照，选用600nm波长进行比浊测定。从早取出的培养液开始依次测定，对细胞密度大的培养液用LB液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0.1~0.65之内(测定OD值前，将待测定的培养液振荡，使细胞均匀分布)。? 7、绘制细菌生长曲线：以时间为横坐标，OD600?值为纵坐标，绘制大肠杆菌的生长曲线。 其细胞数目将随培养时间的延续而发生规律性的变化，如以细胞数目的对数值(或O.D.值) 为纵坐标，以培养时间为横坐标作一条曲线，即为细菌的生长曲线，它反映了细菌的群体生长规律。 [实验步骤]? ?1．准备菌种：将大肠杆菌，枯草杆菌分别接种到装有牛肉膏蛋白胨葡萄糖培养基的三角瓶中，37℃，200r／min振荡培养14-18h．另外准备大肠杆菌单菌落平板l块(37C培养24h)。 ?2．接种：分别将1．5ml(1％接种量)和4-5ml(3％接种量)大肠杆菌菌液和一个大肠杆菌单菌落接人含150ml培养液的三角瓶中．37℃，200r／min振荡培养；把4．5ml枯草杆菌(3% 接种量)接入含150ml培养液的三角瓶中，37℃，200r／min振荡培养。 3．测量；每培养1h取样一次．净培养(不包括取样时间)10h结束培养，测量培养液pH值。零小时也要测。? 如果选用4ml比色皿取500μl培养液到2000μl蒸馏水中(稀释5倍)， 以蒸馏水为对照，测OD650。或OD620或OD600或OD420任选一波长)，如果选用lml 比色皿，可以取1000μl培养液，以蒸馏水为对照，直接测OD620?、OD600或OD420(任选一波长)，当OD值大于0.6时，下一样品要稀释1倍测量． ? [实验结果] 将培养18h的菌株接种于其中，37℃培养，以空白培养基作为对照，每隔2h测定其OD值(λ=600nm) 菌株S1-4经活化后按2%（V/V）接种于MRS液体培养基中，在37℃培 养22h后离心（6000r/min、15min）取上清液，采用直径0.22μm微孔 滤菌器过滤，取得发酵上清液。 将上清液分别用2mol/L NaOH调节pH至（5.50±0.02)，以乳酸和乙酸的灭菌蒸馏水为对照, 以大肠杆 菌为指示菌进行抑菌试验。 在50mmol/L的磷酸缓冲液（pH7.0）中溶解过氧化 氢酶，配成母液，加入