【2017年整理】分子生物学大实验——目的基因的克隆及表达.doc

PAGE PAGE 3 分子生物学大实验——目的基因的克隆及表达 TOC \o 1-3 \h \z \u HYPERLINK \l _Toc534488969 第一节 基因操作概述 PAGEREF _Toc534488969 \h 2 HYPERLINK \l _Toc534488970 一、聚合酶链式反应(PCR) PAGEREF _Toc534488970 \h 2 HYPERLINK \l _Toc534488971 二、质粒概述 PAGEREF _Toc534488971 \h 4 HYPERLINK \l _Toc534488972 三、凝胶电泳 PAGEREF _Toc534488972 \h 5 HYPERLINK \l _Toc534488973 四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 PAGEREF _Toc534488973 \h 6 HYPERLINK \l _Toc534488974 五、重组质粒的连接 PAGEREF _Toc534488974 \h 7 HYPERLINK \l _Toc534488975 六、限制性内切酶消化 PAGEREF _Toc534488975 \h 7 HYPERLINK \l _Toc534488976 七、SDS蛋白质电泳 PAGEREF _Toc534488976 \h 7 HYPERLINK \l _Toc534488977 第二节 材料、设备及试剂 PAGEREF _Toc534488977 \h 7 HYPERLINK \l _Toc534488978 一、材料 PAGEREF _Toc534488978 \h 8 HYPERLINK \l _Toc534488979 二、设备 PAGEREF _Toc534488979 \h 8 HYPERLINK \l _Toc534488980 三、试剂： PAGEREF _Toc534488980 \h 9 HYPERLINK \l _Toc534488981 第三节 操作步骤 PAGEREF _Toc534488981 \h 10 HYPERLINK \l _Toc534488982 一、目的基因的获得： PAGEREF _Toc534488982 \h 10 HYPERLINK \l _Toc534488983 二、pET-21bT（pET-21bR、pET-21b）载体的获得： PAGEREF _Toc534488983 \h 11 HYPERLINK \l _Toc534488984 三、pET-21b等与目的片段的连接作用 PAGEREF _Toc534488984 \h 12 HYPERLINK \l _Toc534488985 四、转化大肠杆菌DH5α进行阳性克隆子筛选与鉴定 PAGEREF _Toc534488985 \h 13 HYPERLINK \l _Toc534488986 五、转化转化大肠杆菌BL21plyst，摇菌进行SDS电泳。 PAGEREF _Toc534488986 \h 14 HYPERLINK \l _Toc534488987 六、融合蛋白的毒力测定 PAGEREF _Toc534488987 \h 16 HYPERLINK \l _Toc534488988 第四节 本实验的实验报告 PAGEREF _Toc534488988 \h 16 第一节 基因操作概述 一、聚合酶链式反应(PCR) PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤：(1)变性(Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链；(2)退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；(3)延伸(Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA扩增达106倍。　　（一）、PCR反应中的主要成份　　1、引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1)引物长度约为16～30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。(2)引物中G+C含量通常为40%～60%，可按下式粗略估计引物的解链温度Tm＝4(G+C)+2(A+T)。(4)引物3端最好与目的序列阅读