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藥学本科分子生物学实验指导
实验项目一:总RNA的提取(必做)
一、实验学时:6学时
二、实验目的
通过本实验学习总RNA的提取和分析方法。
三、实验内容
利用匀浆裂解细胞,采用TRilzol试剂盒抽提RNA去除蛋白质和DNA。
四、实验要求
学会提取基因组RNA的方法和操作过程
提取RNA时,要特别注意防止RNase的污染,所用玻璃器皿均应用0.1%的二乙基焦碳酸盐(diethyl pyrocarbonate,DEPC)处理。塑料器材均使用一次性用品,并高压灭菌处理,必要时,也可用0.1%DEPC处理。
五、实验所需仪器设备
移液器及吸头, 电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪等
六、实验原理
TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。最大特点是可同时分离一个样品的RNA\DNA\蛋白质.TRIzol使样品匀浆化,细胞裂解,溶解细胞内含物,同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后,溶液分为水相和有机相,RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA;
、实验步骤4℃(预冷半个小时)。准备冰盒。
5.戴口罩, 戴手套 。
6. 每个EP管中,加入100mg左右的组织,加入1mL Trizol 试剂,
7. 超声破碎仪破碎细胞
8. 剧烈震荡30秒,室温静置10分钟。
9.加入200uL氯仿(三氯甲烷),剧烈震荡30秒,室温静置5分钟。
10. 离心:4℃,13,000rpm,10min。
11.取新EP管。将上层水相(约600uL)加入新EP管,
12. 再加入500uL异丙醇,室温静置10分钟。
13. 离心:4℃,13,000rpm,10min。
14. 去上清夜,加入20-30 uL DEPC水,55℃10min,以完全溶解RNA。
15 .-70度保存提取的总RNA。
八、注意事项 .RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类,除了细胞内源RNA酶外,外界环境中均存在RNA酶,所以操作时应戴手套。实验项目二:总RNA的纯化和鉴定(必做)
一、实验学时:6学时
二、实验目的
通过本实验学习总RNA的纯化和利用琼脂糖电泳鉴定的方法
三、实验内容
1、通过选择性沉淀RNA分子去除DNA。
2、琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA
四、实验要求
1、学会纯化植物总RNA的方法
2、学会定量、定性检测RNA的方法
五、实验所需仪器设备
移液器及吸头,水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪,照相机、紫外分光光度计
六、实验原理
乙醇能够消除核酸的水化层,使带负电荷的磷酸基团暴露出来。在阳离子的量中和暴露的磷酸残基的电荷沉淀。由于细胞中70-80%的RNA为rRNA,电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb,分别相当于28S和18S rRNA;植物叶片中由于含有大量的叶绿体RNA,可见4条或更多rRNA;细菌rRNA大小分别约为4kb和2kb,分别相当于细菌23S和16S rRNA。RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍,否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。OD260/OD280比值是衡量RNA样品中蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA样品,OD260/OD280值(10mM Tris, pH7.5)在2.0左右。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品,假定在10mM Tris,pH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数在1.8-2.1之间,在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间,但这并不表示RNA不纯。取一定量的RNA提取物,用RNase-free水稀释n倍,用RNase-free水将分光光度计调零,取稀释液进行OD260测定,按照以下公式进行RNA浓度的计算:???终浓度(ng/μl)=OD260×n (稀释倍数)×40
七、实验步骤
(一)?总RNA的75%乙醇500uL洗涤。
2. 离心:4℃,7,500rpm,5min。
3.去上清液,加入无水乙醇500uL洗涤。
4 离心:4℃,7,500rpm,5min。
5.去上清液,空气干燥5-10分钟。(RNA不可以完全干燥,防止复溶的时候困难)
6. 加入20-30 uL DEPC水,55℃10min,以完全溶解RNA。
(二) 总RNA质量的检测(完整性的检测)
1.称取琼脂糖0.2 g,溶于盛有ml的 TAE(电泳缓冲液)的锥形瓶中;50×TAE: 242 g Tris 碱+ 57. 1 ml 冰醋酸+ 37. 2 g Na2EDTA·2H2O 配成1L 于4 ℃储备),
2.将上述液体置于微波炉中火煮2-3分钟(以琼脂糖完全熔化为准);加热时应
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