藥学本科分子生物学实验指导.docVIP

实验项目一：总RNA的提取（必做） 一、实验学时：6学时 二、实验目的 通过本实验学习总RNA的提取和分析方法。 三、实验内容 利用匀浆裂解细胞，采用TRilzol试剂盒抽提RNA去除蛋白质和DNA。 四、实验要求 学会提取基因组RNA的方法和操作过程 提取RNA时，要特别注意防止RNase的污染，所用玻璃器皿均应用0.1％的二乙基焦碳酸盐(diethyl pyrocarbonate，DEPC)处理。塑料器材均使用一次性用品，并高压灭菌处理，必要时，也可用0.1%DEPC处理。 五、实验所需仪器设备 移液器及吸头， 电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪等 六、实验原理 TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。最大特点是可同时分离一个样品的RNA\DNA\蛋白质.TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA； 、实验步骤4℃（预冷半个小时）。准备冰盒。 5．戴口罩， 戴手套 。 6. 每个EP管中，加入100mg左右的组织，加入1mL Trizol 试剂， 7. 超声破碎仪破碎细胞 8. 剧烈震荡30秒，室温静置10分钟。 9．加入200uL氯仿（三氯甲烷），剧烈震荡30秒，室温静置5分钟。 10. 离心：4℃，13,000rpm，10min。 11．取新EP管。将上层水相（约600uL）加入新EP管， 12. 再加入500uL异丙醇，室温静置10分钟。 13. 离心：4℃，13,000rpm，10min。 14. 去上清夜，加入20-30 uL DEPC水，55℃10min，以完全溶解RNA。 15 .-70度保存提取的总RNA。 八、注意事项 ．RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞内源RNA酶外，外界环境中均存在RNA酶，所以操作时应戴手套。实验项目二：总RNA的纯化和鉴定（必做） 一、实验学时：6学时 二、实验目的 通过本实验学习总RNA的纯化和利用琼脂糖电泳鉴定的方法 三、实验内容 1、通过选择性沉淀RNA分子去除DNA。 2、琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA 四、实验要求 1、学会纯化植物总RNA的方法 2、学会定量、定性检测RNA的方法 五、实验所需仪器设备 移液器及吸头，水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪,照相机、紫外分光光度计 六、实验原理 乙醇能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。在阳离子的量中和暴露的磷酸残基的电荷沉淀。由于细胞中70-80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当于28S和18S rRNA；植物叶片中由于含有大量的叶绿体RNA，可见4条或更多rRNA；细菌rRNA大小分别约为4kb和2kb，分别相当于细菌23S和16S rRNA。RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。OD260/OD280比值是衡量RNA样品中蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA样品，OD260/OD280值（10mM Tris, pH7.5）在2.0左右。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mM Tris，pH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数在1.8-2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：???终浓度（ng/μl）=OD260×n (稀释倍数)×40 七、实验步骤 （一）?总RNA的75%乙醇500uL洗涤。 2. 离心：4℃，7,500rpm，5min。 3．去上清液，加入无水乙醇500uL洗涤。 4 离心：4℃，7,500rpm，5min。 5．去上清液，空气干燥5-10分钟。（RNA不可以完全干燥，防止复溶的时候困难） 6. 加入20-30 uL DEPC水，55℃10min，以完全溶解RNA。 （二） 总RNA质量的检测（完整性的检测） 1．称取琼脂糖0.2 g，溶于盛有ml的 TAE（电泳缓冲液）的锥形瓶中；50×TAE: 242 g Tris 碱+ 57. 1 ml 冰醋酸+ 37. 2 g Na2EDTA·2H2O 配成1L 于4 ℃储备)， 2．将上述液体置于微波炉中火煮2-3分钟（以琼脂糖完全熔化为准）；加热时应