7凝胶过滤层析法纯化牡蛎碱性磷酸酶[精].ppt

实验十 凝胶过滤柱层析纯化碱性磷酸酶 一、目的要求 1.学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的原理与方法。 2.通过凝胶过滤柱层析对碱性磷酸酶进行纯化 二、原理 凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。 优点： a. 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析柱可反复使用 凝胶的类型： Sephadex: 交联葡聚糖 Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel A Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛 Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶 凝胶及柱的选择 样品上柱 分析用量：柱床体积的1—2% 制备用量：柱床体积的10—20% 洗脱收集 部分收集器、核酸蛋白检测仪 凝胶的保存方法 0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰 四、操作方法 （一）凝胶的选择与处理 1.凝胶及柱的选择 选择Sephadex G50和1.5cm×60cm的柱子。 2.凝胶的处理 凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。 （二）装柱 1.装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出。 2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约5cm高度柱容积的洗脱液，然后边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。 （三）凝胶柱的平衡 通过2-3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保护凝胶上端有一段液体。 五、注意事项 1）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。 2）装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此凝胶。 3）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。 六、思考题 1.在本实验中要注意哪些重要环节？ * * 色谱的历史知识 层析 色谱 Chromatography 茨维特（Mikhail Tswett，俄国植物学家），1901年，植物色素分离 1952 年，James 和Martin 发明了气相色谱，获得1952 年的诺贝尔化学奖 用于生物分子分离分析的色谱技术 液相色谱（常压液相色谱、高压液相色谱-HPLC）、吸附色谱（柱色谱、薄层色谱）、离子交换色谱、亲和色谱、金属螯合色谱（“镍柱”）、排阻色谱（凝胶色谱） 5000-500000 5000-300000 4000-150000 3000-70000 1500-20000 5000 1500 700 工作范围（肽与蛋白）D 20.0 15.0 10.0 7.5 5.0 2.5 1.5 1.0 吸水量 （g/g干凝胶） G-200 G-150 G-100 G-75 G-50 G-25 G-15 G-10 凝胶的处理及装柱 凝胶干粉的溶胀（热溶胀）、浮选、抽气、装柱、蓝色葡聚糖检查、平衡 装柱时要注意操作压。 装柱的两种方法： a.手工操作 1/3床体积水→加入少许凝胶积起1-2厘米凝胶床→打开出水口→连续缓慢加入凝胶 b.电动搅拌下的装柱法 （如图4-9） 实验步骤 1、按图示排列将凝胶柱及各仪器连接好。 （1）凝胶柱的出水口与紫外检测仪的进水口（打“?”符号者）连接，通过软管将紫外检测仪的出水口（打“⊙”符号者）与部分收集器连接； （2）用红、黑两条连接线将紫外检测仪与记录仪相连接—“红接红”、“黑接黑”； 2、依次打开紫外检测仪、部分收集器、记录仪开关，对仪器进行预热。 3、通过“量程/零位”切换开关，设定记录仪的量程为“10mv”，取下记录笔的笔套，检查记录笔是否可书写。 4、转动紫外检测仪右侧板上的波长旋钮，设定检测波长为280nm。 5、打开凝胶柱出水口的夹子，使洗脱缓冲液流经检测器。把“灵敏度”旋钮选择到“100%”档，调节“光量”旋钮，使检测仪窗口数字显示为100，即透光率为100%。再将“灵敏度”开关转到“0.5A”档，缓慢调节“调零”旋钮，检测仪数字显示为“0”，并使记录仪指针在“0”位。以上步骤需反复调节几次，待层析系统平衡后，即可加样检测。 （注意：在样品检测的过程中，不可再调节“调零”、“光量”旋钮！）