8固定化酶[精].ppt

酶与载体应结合牢固，从而使酶能回收贮藏，利于反复使用 所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应 固定化酶成本要低，以利于工业使用 操作简单， 处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶。 但容易受缓冲液影响，在离子强度高的条件下进行反应时，酶往往会从载体上脱落。 界面聚合法 利用在微滴的界面通过加成或缩合反应形成水不溶性多聚体制成微囊包埋酶。 例：以尼龙膜包埋酶时，将酶液及亲水性单体（如己二胺）溶于水制成水溶液。另外，将疏水性单体（癸二酰氯等）溶于氯仿或甲苯等与水混溶的有机溶剂。然后，将这两种互不相溶的液体混和在一起。加入乳化剂乳化，使酶液分散成小液滴。此时，亲水性的已二胺与疏水性的癸二酰氯就在二相界面聚合成半透膜，将酶包埋在小球内。再加Tween—20，使乳化破坏，用离心分离即可得用半透膜包埋的微囊型固定化酶。 表面活性剂乳化液膜法 在酶的水溶液中添加表面活性剂，使之乳化形成液膜达到包埋的目的。该法不含化学反应，简便，而且固定化是可逆的，但有渗漏的可能性。 酶经固定化后，提高了对蛋白质变性剂和抑制剂的抵抗能力 氨基酰化酶与固定于DEAE-Sephadex的氨基酰化酶比较，前者在6mol、2mol胍、1％SDS和4mmol丙酮溶液中活力分别为9％、49％、1％和55％，而后者在相应溶液中活力则分别为146％、117％、35％和138％。 靶向前体药物是将药物化学修饰成不显活性的衍生物，导向到靶组织后，被特异的酶转化为活性药物。 微球制剂和脂质体制剂也可以偶联抗体以增强靶向性。细胞表面的糖复合物也可作为靶向目标。 需将单抗人源化以避免异源物质引起的免疫反应 肿瘤细胞免疫原性弱，不均一，难以找到普适的抗体 制备困难、造价高 三、固定化酶的性质 固定化后酶活力的变化 固定化对酶稳定性的影响 固定化酶的最适温度和最适pH变化 固定化酶的米氏常数变化 1、固定化后酶活力的变化 固定化酶的活力大多比天然酶小，其专一性也能发生改变。 固定化胰蛋白酶对高分子底物只显示原酶活力的30%，而对低分子底物的活力保持80%。 固定化酶活力低于原酶的原因： 固定化过程影响活性中心的构象 固定化影响酶分子活性中心对底物分子的定位作用 内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻 酶被包埋时，半透膜影响大分子底物与酶的接近 2、固定化对酶稳定性的影响 大多数情况下，酶经过固定化，其稳定性都有所增加。包括热稳定性提高；对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高；对不同pH、蛋白酶、贮存和操作条件的稳定性提高。 原因：固定化防止了酶分子的伸展变形；固定化使酶活力缓慢释放；抑制酶的降解 固定化酶的热稳定性变化 1—固定化酶；2—天然酶 大多数酶在固定化后与溶液酶相比，有较高的热稳定性。 氨基酰化酶溶液酶在75℃保温15min，活力为0；DEAE-Sephadex固定化酶在同样条件下仍有80％；DEAE-纤维素固定化酶在同样条件下还有60％活力。其他如固定化乳酸脱氢酶、脲酶等都比溶液酶的热稳定性提高， 溶液酶经固定化后提高了对蛋白酶的抵抗能力。 氨基酰化酶在胰蛋白酶作用下活力仅存20％，而将其固定于DEAE-纤维素上在同样条件下仍有80％的活力。 3、固定化酶的最适温度 和最适pH的变化 固定化后酶的最适温度随之提高。 酶固定化后，对底物作用的最适pH和酶活力-pH曲线常发生偏移。 原因:微环境表面电荷性质的影响。 带负电荷的载体，往往导致固定化酶的最适pH向碱性方向移动；带正电荷的载体则相反。 天冬酰胺酶固定化前后的酶活力-pH曲线 　　1—固定化酶；2—游离酶 4、固定化酶的米氏常数变化 固定化酶的表观米氏常数随载体的带电性能变化 载体电中性时，表观Km上升 载体电荷与底物相反时，表观Km低于溶液酶Km 载体电荷与底物相同时，表观Km显著增加 固定化酶制备物性质取决于所用的酶及载体材料的性质 (1)酶固定化后的变化主要是活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生变化 (2)载体影响主要是在固定化酶的周围形成了能对底物产生立体影响的扩散层及静电的相互作用等引起的变化 总结影响固定化酶性能的因素 四、固定化酶的应用 药物控释载体 生物传感器 药物应用临床不顺利的原因: 蛋白类药物被胃酸破坏；被肝和血液中的酶系统清除；难以穿透细胞膜；药物本身毒副作用；免疫问题；药物稳定性差 药物新剂型发展的核心特点： 从时间和空间的分布上控制药物的释放 1、药物控释载体 聚合物修饰