一株猪流行性腹泻病毒（PEDV)的鉴定及分离培养.docVIP

一株猪流行性腹泻病毒（PEDV)的鉴定及分离培养 摘要 猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一类急性、高度接触性传染病,主要临床症状为呕吐、腹泻、脱水性下痢。因PED对新生仔猪的高致死率，所以每次爆发都会对养猪业造成严重经济损失。我国是主要发病国之一，自2010年起该病的发病率明显升高，且规模更大。 由于近年来猪流行性腹泻的频繁爆发，使其成为世界范围的猪传染病。2013年美国首次报道猪流行性腹泻案例，并且短时间内迅速扩散蔓延。同年，QiChen等成功分离出美国传播的一株PEDV流行毒株。本实验室近些年来致力于PEDV减毒活疫苗的研究工作，已经取得了一定进展，相继得到了不同类型的重组PEDV，但尚未进行过PEDV流行毒株的分离培养。本实验尝试以Vero细胞分离出PEDV-GJL野毒株，为今后通过RNA定向重组构建PEDV重组病毒提供各大的研发空间。 PEDV的主要致病蛋白是纤突蛋白（S蛋白），且编码纤突蛋白的S基因突变率较高，所以根据S基因的遗传变异关系可以一定程度上反应PEDV流行毒株的爆发时间与地区性。本研究首先进行临床样本中PEDV野毒株S基因全序列的扩增测序，然后借鉴QiChen等的培养方案，在病毒维持液中添加TPB、酵母粉、5μg/μL胰酶，延长培养周期等，以期在Vero细胞上分离出PEDV-GJL野毒株。 分离得到的毒株在Vero细胞上的CPE并非常见流行毒株的合胞体状态，而是类似DR13的病变形态。进一步做对比实验发现病毒的增殖不依赖外界胰酶的存在，初步怀疑是否是DR13毒株。经RT-PCR检测ORF3序列，发现分离到的是PEDV-GJL和DR13减毒疫苗株的混合毒株，并且病毒增殖传至第四代时野毒株PEDV-GJL丢失。取第二代病毒进行两次空斑纯化实验，分别挑取大、小不同蚀斑后得到的病毒经鉴定都是弱毒DR13疫苗株。 由分离纯化结果分析，猪场免疫过弱毒DR13疫苗，采集临床粪便样品时携带有疫苗毒株。样品RT-PCR检测时未发现疫苗株的存在，但随后分离过程中在Vero细胞上大量增殖。病毒接种后维持液中添加TPB和酵母粉是为了维持营养，但根据本实验结果可能这套体系对疫苗株的分离更加有利，这个假设还需要后续进一步验证。 PEDV同源病毒的构建是基于本实验室已建立的反向遗传学操作系统，以携带荧光标记的重组质粒载体PEDVwt-DR13-dORF3/RLUC为模板转录出病毒基因组RNA，通过电击转染方法将RNA导入感染重组病毒mPEDV的LR7细胞中，经病毒的重新装配得到能在Vero细胞内增殖的重组PEDV病毒。 关键词：猪流行性腹泻病毒（PEDV）；RT-PCR;KEY WORDS :PEDV ;RT-PCR;Real-time PCR; Neautralization Porcine epidemic diarrhea (PED) is a kind of highly contact transmitted disease that is characterized by acute enteritis,which causing vomit,diarrhea and dehydration.The causative agent of PED is Porcine epidemic diarrhea virus(PEDV).Every time of the outbreak will cause serious economic loss because of the high lethality to newborn piglets.China is one of the majior disease areas,and since 2010the incidence of PED increased significantly with larger scale. In recent years,the frequent outbreak of PED,making it a pig infectious disese worldwide.PED was first reported in USA at May 2013 and spreading rapidly with a short time.In the same year, Qichen et successfully isolated two strains of PEDV that propagating in US.Our laboratory committed to the research of attenuated live vaccine of PEDV in recent years,and has mad