食品微生物A實验指导.docVIP

实验一 普通光学显微镜的使用 一、实验目的 1、了解显微镜的构造和原理 2、掌握普通光学显微镜的使用方法和细菌基本形态的观察方法。 二、实验原理 普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，其中物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。显微镜的两个重要性能参数是反差和分辨率。分辨率指能辨别两点之间距离的能力，表示为D=λ/2NA，λ为光波波长，NA为物镜的数值孔径，取决于物镜与介质的折射率和镜口角（NA = n·sinθ）。香柏油（折射率为1.5，空气为1.0）作介质，其NA可接近1.5，其分辨率可达到0.22um，大部分细菌直径在0.5um以上，因此用油镜可以更清楚的观察细菌的个体形态。 三、仪器、材料与试剂 标本片、显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸 四、实验步骤 1、调节光照：利用灯光或自然光通过反光镜来调节光照，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用平面镜或者凹面镜（光线较强的天然光源宜用平面镜；光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，但不能用直射阳光，直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼睛）并调节其角度，使视野内光线均匀，亮度适宜。 2、低倍镜观察：将标本片放在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜调至接近标本处，用目镜观察并同时用粗调节旋钮调节，直至物像出现，再用细调节旋钮使物像清晰为止，用推动器移动标本片，认真观察各部分。 3、高倍镜观察：在低倍镜下找到合适的观察目标并移至视野中心，转动高倍镜至工作位置，用同样的方法调节粗细调节旋钮使物象清晰，观察。 4、油镜观察：高倍镜下找到观察区域后，将镜筒抬高，将油镜转至正下方。在标本的镜检区域滴一滴香柏油。从侧面注视，（用粗调节器）将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中。（其镜头几乎与标本相接，应特别注意不能压在标本上，更不可用力过猛，否则不仅压碎玻片，也会损坏镜头）（从目镜内观察）进一步调节光线，使光线明亮，再用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野出现物像为止，然后用细调节器校正焦距，使出现的物象清晰、观察。（如油镜已离开油面而仍未见物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作至物像看清为止。） 5、还原与保养 下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许二甲苯擦去镜头上残留油迹，再擦去残留的二甲苯，（注意向一个方向擦拭）。将各部分还原，转动物镜，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成八字形位置，再将载物台下降至最低，洁载物台等机械部分，套上镜套，放回原处。 五、注意事项 1、拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿，镜座距实验台边缘不低于10cm。 2、镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度，有盖玻片的可直接用擦镜纸擦拭，无盖玻片的要小心的用擦镜纸拖拭香柏油和二甲苯，防止将标本擦掉。 3、观察标本时，必须依次用低、高倍镜，最后用油镜。 六、作业：绘出观察到的细菌形态图。 实验二 细菌的染色 一、实验目的 1、学习革兰氏染色的原理。 2、掌握革兰氏染色的方法。 二、实验原理 革兰氏染色是细菌学中最重要的鉴别染色法。（它是1884年由丹麦医师Gram创立的）可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 三、材料与试剂 1、菌种：大肠杆菌、葡萄球菌。 2、试剂：结晶紫染色液、碘液、95%乙醇、番红染色液。 3、仪器用品：显微镜、酒精灯、接种环、载玻片、镊子、香柏油、二甲苯、吸水纸、擦镜纸。 四、实验步骤 1、涂片：取一干净的载玻片于实验台上，用灭菌接种环由大肠杆菌、葡萄球菌混合菌液中取1~2环菌液于载玻片上，涂抹至大小均匀、厚度适宜的程度。 2、干燥：载玻片在酒精灯上方火焰高处烘干或自然干。 3、固定：将标本片迅速通过火焰三次，予以固定。 4、染色：（1）初染：滴加结晶紫一滴于玻片涂面上，染色1~2分钟，倾去染色液，用细水流冲至洗出液为无色，用吸水纸吸干。 （2）媒染：滴加碘液染色一分钟，水洗吸干。 （3）脱色 滴加95％酒精，脱色约20~30秒钟，立即用水冲净酒精，吸干水分。 （4）复染：滴加番红，复染1