WesternBlotting綜述.doc

Western Blotting 定义: 免疫印迹是一个用于蛋白质分析的常规技术，在电场的作用下将电泳分离的蛋白从凝胶转移至一种固相支持物，然后利用抗原-抗体的特异性反应，从蛋白混合物中检测出目标蛋白，从而定量或定性的确定正常或实验条件下细胞或组织中目标蛋白的表达情况。它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。western blot 是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。 特点: Western Blot结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种优点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。 组成: 典型的印迹实验包括三个步骤①蛋白质的电泳分离；②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域；③免疫学检测。免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。 第一步是做SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。 第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上，用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC 膜)和PVDF 膜，蛋白转移的方法多用电泳转移，它又有半干法和湿法之分，现在大多用湿法。 第三步是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测的方法可以是直接的和间接的。现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体杂交结合后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗第一抗体的抗体）杂交结合，再加酶的底物显色或者通过膜上的颜色或X 光底片上暴光的条带来显示抗原的存在。该技术被广泛应用于蛋白表达水平的检测中。 基本原理以及操作 第一部分：SDS电泳 电泳样品的制备蛋白质的变性. 蛋白中含有很多的氨基(+)和羧基(-)，不同的蛋白在不同的PH值下表现出不同的电荷， 为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，我们在上样前，通常会进行一些处理(上样 缓冲液)。即在样品中加入含有SDS 和β-巯基乙醇的上缓冲液。SDS 即十二烷基磺酸钠 （CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+），是一种阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的 氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构； β-巯基乙醇是强还原剂，它可以断开半胱氨酸 残基之间的二硫键。电泳样品加入样品处理液后，经过高温处理，其目的是将SDS 与蛋白质 充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构同时使整个蛋白带上负电荷；另外 样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，溴酚蓝指示剂是一个较小的分子，可以自由通过凝胶孔径，所以它显示着电泳的前沿位置，当指示剂到达凝胶底部时，即可停止电泳。用于监控整个电泳过程；另外样品处理液中还加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。 当样品上样并接通两极间电流后(电泳槽的上方为负极，下方为正极)，在凝胶中形成移动界面并带动 凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物向正极推进。样品首先通过高度多孔性的浓缩胶，使样 品中所含SDS 多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。 2、 凝胶制备以及电泳 2.1 SDS凝胶配制 配制相应浓度的SDS分离胶，TEMED加入后迅速混匀制胶，沿壁迅速灌注分离胶溶液，留出积层胶所需空间（梳齿长再加1cm）。覆盖5mm水(或异丙醇）层于分离胶溶液上，约30-60min后分离胶和水层之间会出现清晰界面，表明分离胶充分聚合（可微微倾斜模具，检测凝胶是否聚合）。 ddH2O轻轻洗涤凝胶顶部数次，以除去未聚合的凝胶，再用滤纸吸净残留液体，注意不要接触胶面。 覆盖层可保持胶面平整和防止空气进入，因为氧气扩散进入凝胶会抑制聚合反应。 灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。 胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。 配制相应体积的积层胶液体，在已聚合分离胶上直接灌注积层胶液体，立即插入加样梳，并在空隙处补足积层液液体（小心避免混入气泡），室温静置30～60min至完全聚合，将凝胶固定于电泳装置上，上、下槽加入Tris甘氨酸电泳缓冲液，至少要淹没加样孔。小心拔出加样梳，避免损坏加样孔，如加样孔有气泡，可向其中加入适量电泳缓冲液将气泡驱除；若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正。 凝胶的质量直接影响以后的实验结果，要特别注意几点：凝胶要均一没有气泡；积层胶与分离胶