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《微 生 物 工 程》 实验指导 曾 松 荣、柯 野 编 韶关学院 英东生命科学学院 （适用专业：10级本科生物技术） 重组毕赤酵母发酵表达蛋白酶及其初步鉴定 一、实验目的 1、学习重组毕赤酵母培养基产物表达的方法。 2、学习发酵过程中菌体浓度的测定。 3、学习表达的重组蛋白酶的鉴定及其酶活的测定。 二、实验内容 1、毕赤酵母的菌体生长和诱导表达的培养基的制备。 2、重组毕赤酵母生长菌体曲线的测定。 3、对重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达。 4、对重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达发酵液的酶活测定。 5、SDS鉴定重组蛋白酶。 三、实验原理 蛋白酶是催化蛋白质化合物中肽键水解为小肽或氨基酸的一类酶总称，广泛存在于 动物内脏、植物茎叶、果实及微生物中，并且对生物体的生理调控、催化各种代谢反应 等方面具有重要的作用。蛋白酶是一类重要的工业用酶，约占整个工业用酶量60%以上； 广泛应用于食品加工、皮革、医药和化工等行业。由于蛋白酶具有广泛的工业、食品和 医药等方面的应用价值，目前工业上需求量大。植物中提取的蛋白酶主要是中性蛋白酶。 植物蛋白酶生产依赖于植物种植，这易受到季节、地理、气候等多因素的影响致使来源 不稳定。动物源性蛋白酶多从牛、羊和猪等的胰脏中提取而得。动物来源蛋白酶生产成 本较高，并受到世界动物保护协会和人员的强烈反对，目前主要用于医药方面。因此， 动植物源蛋白酶不能满足当代工业的需要。微生物源蛋白酶几乎具有所有植物和动物来 源蛋白酶的应用特性，成为了目前的蛋白酶的重要来源。据统计，微生物蛋白酶占据了 世界蛋白酶销售大约 70%以上的份额。 目前商业化的蛋白酶主要来源于芽孢杆菌，中性蛋白酶来自植物木瓜，而来源于真 菌的极少。目前，国内外学者对来源于霉菌的蛋白酶的研究主要集中于通过优化固体(或 者液体)发酵来提高蛋白酶的产量或通过分离纯化其产生的部分酶进行性质研究；而优 化发酵条件很难大幅度提高蛋白酶产量，且发酵过程易受多种因素(如易污染或菌株生 长状态)影响。并且霉菌产生的蛋白酶种类较多，这增加了蛋白酶的纯化难度，阻碍了 其进一步的开发利用。因此采用基因工程技术，利用霉菌的蛋白酶基因整合到毕赤酵母 的基因组上构建工程菌株，利于高产获得重组霉菌蛋白酶。 毕赤酵母表达系统是目前表达异源蛋白性能较好的系统之一，其操作工艺简单，表 达量高。该表达系统能对表达的蛋白进行折叠和翻译后修饰，获得具有活性的目的蛋白， 该目的蛋白能直接分泌至发酵液中便于分离与纯化。毕赤酵母曾被用于生产单细胞蛋白 （SCP），有很好的发酵基础，菌体密度可达100g/L干重。其生长培养液的组分包括无机 盐、微量元素、生物素、氮源和碳源，廉价而无毒。它能在以甲醇为唯一碳源的培养基 中快速生长，其中醇氧化酶AOX-甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30%。 而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。AOX的合成是在转 录水平调控的。其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。此调 控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导又重机制控制的。外源基因在甲醇以外 的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。 四、器材与试剂 1、菌种：重组蛋白酶毕赤酵母工程菌株，本菌株由本实验室自己构建保藏。 2、培养基 BMGY培养基：酵母提取物10.0 g，胰蛋白胨20.0g，YNB 13.4g，500×生物素溶液 （4×10-5%生物素）2.0 mL，甘油 10.0 mL，1M 磷酸钾(pH6.0) 100.0 mL，蒸馏水900mL。 BMMY 培养基：酵母提取物10.0 g，胰蛋白胨20.0g，YNB 13.4g，500×生物素溶 液（4×10-5%生物素）2.0 mL，甲醇 10.0 mL，1M 磷酸钾(pH6.0) 100.0 mL，蒸馏水900mL。 3、试剂 福林试剂(Folin试剂)：于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4.2H2O) 100g，钼酸钠(Na2MoO4.2H2O) 25g，蒸馏水700mL，85%磷酸50mL，浓盐酸100mL， 文火回流10h。取去冷凝器，加入硫酸锂(Li2SO4) 50g，蒸馏水50mL，混匀，加入几滴 液体溴，再煮沸15min，以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色