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临床荧光PCR结果分析及常见问题 中国人民解放军三零二医院 王海滨 一、荧光 PCR 技术在临床诊、疗中的应用 PCR 技术是于 1983 年由 Mullis 发明，后来传到我国，但是由于实验污染的问题， 1998 年卫生部取缔 PCR 实验方法在临床诊断中的应用。荧光 PCR 出现后，污染减少很多，但近几年由于磁珠的应用，污染又再起。 2003 年， PCR 在 SARS 的早期诊断中非常有效，当时使用的是电泳法。 H1N1 甲型流感（ 2009 ）：荧光 PCR 技术作为确诊指标（ 755 份 / 天）。疾病易感基因的研究（ SNP ）： CR1/ 丙型肝炎 IL-28B 。疾病（肿瘤）易感基因的鉴定。 二、影响临床荧光 PCR 检测结果的因素 （一）影响临床荧光 PCR 检测结果的常见因素 1. 检验因素： 实验室硬件、仪器、试剂、人员素质、技术水平、管理水平。 2. 非检验因素： 标本采集、质量、部位、标本保存、条件、时间、标本中的干扰物质、样本丢失！ （二） 加强检测前标本的质量管理——避免问题重复发生 规范标本前处理流程、制度化的重要性，建立不合格标本记录和定期总结制度、制定解决措施与可行路径（编号和项目错误等），查找标本丢失可能的环节。加强本室新进工作人员流程培训，经常性进行临床医护的交流与培训。 （三） 实验室分区 分为：试剂配制、核酸提取、 PCR 扩增以及开放产物分析等区域。 分区目的：通过物理分割达到标本、试剂或使用器具等被沾染或掺入污染，标本间的交叉污染等。 分区要求：至少要有清洁的试剂配制和核酸制备区 三、试剂配制 （一）试剂配制室的设置与维护 以空间内无核酸气溶胶为准！ 1 ．正压、清洁进风 ( 壁挂式空调 ) 。 试剂冰箱内勿存放病原或核酸相关物品！定期清洁除霜！ 2 ．有效氯消毒液清洁实验室台面、地面。 3 ．移液器：使用前的清洁。 4 ．离心机等：每周定期木浆纸巾擦拭，方法。“一次性物品的使用 - 从 COBAS 的“浪费”中找到均衡！ （二）试剂配制注意事项 试剂配制实际是简单的问题，但是也是非常复杂的环节。 1. 何时配制？如何配制！ 在核酸制备好后再进行试剂配制，注意反复冻溶对试剂质量的影响，以及久配不用试剂对检测的影响 ( 如 hot-TaqE) 。 2. 如何避免荧光淬灭？ 避免在强光下配制，采用有效氯消毒液后应进行通风或清水擦拭，勿在紫外灯下配制。 3. 交叉污染的避免 试剂与核酸何者先加更合理？ 试剂分配中的问题：过吸、残滴（第一孔）。 热盖不能完全阻止蒸发，石蜡油，盖、膜、离心。 （三）试剂配制环境对检测的影响 PPT8 显示的是试剂配制环境对检测的影响，左边的图，是实验室在装修的时候用了一些油漆，在那个环境里面配制的试剂。右边的图，是在无油漆环境下配制的。可以看到左边的图结果很差。 （四）核酸制备 冻存标本使用前要混匀离心后使用；不同类型标本：血清、血浆、细胞、组织、乳汁、痰液、尿液等；标本核酸提取前后的保存；提取后核酸的保存（稳定性）；核酸提取标本加入量与核酸得率的关系！ 1+1 与 2 的关系；指示剂的引入，可以降低差错率。 PPT10 显示的是指示剂在一管法的应用，可以看到上面蓝色的是核酸提取液，非常清楚，降低了差错。 四、 荧光 PCR 扩增 （一）实验室怎么建？ 独立区域、负压通风、物品专用： 1. 实验室清洁用品的专用的重要性。 2. 扩增产物的处理（ PCR 管加盖、封膜、石蜡油），用两层封口袋包装后焚烧（如 PPT12 图）。产物的处理必须由专业工作人员或经过培训的工作人员处理。禁止未经培训的研究生、实习生和进修生进入区域对扩增产物进行操作。 3. 仪器清洁处理程序：载板区先用 70% 乙醇清洁。该区所有垃圾需封闭运输并销毁。 4. 地面和空气处理原则。 （二） 荧光 PCR 仪器如何选择？ PCR 实验室的仪器非常多有几十种，应按照实验的要求不同来进行选择。 （三）荧光 PCR 仪器如何维护？ 荧光 PCR 仪器的功能模块分为三个： 1. 温度模块 包含最基本的升降温。要保证温度模块的均一性，既不能有边缘效应，也不能有局部温度的影响。 2. 光学模块 即测光系统， PCR 反应的过程中每一个循环都要测一次光，测光不论是照相还是扫描，都有一定的差别，光学模块的敏感性要高。 3. 软件模块 荧光信号采集以后，要用软件模块来进行分析。分析不但要人性化，而且还要准确，不能有故障。 （四）荧光 PCR 扩增循环数量的选择（ 60:50:40cycles ） COBASTAQMAN 用的是 60 个循环，早期是 40 个循环，近几年的荧光 PCR 试剂，循环