第25章临床酶法的原理与方法研究报告.ppt

第二十五章临床酶法分析的原理与方法 1 2 缺点 催化该反应的POD对底物专一性差，标本中其它过氧化物也可一起被转化，使测定结果偏高。 反应过程中可受到数十种还原性物质的干扰。 常采用双试剂剂型排除干扰。 应用抗坏血酸氧化酶和胆红素氧化酶加入试剂Ⅰ中，可排除样本中维生素C和胆红素干扰。 第五节 酶循环测定的原理与方法 酶循环测定法是酶法分析的发展和延伸。酶循环测定法的关键技术是利用酶促反应中的酶在反应前后质和量都不改变的特性，只要有足够的底物，即可一直催化反应下去，底物靠其生成的非信号产物循环提供，使可测信号越来越大，提高了检测的灵敏度。 酶循环测定法利用底物和辅酶之间的循环反复反应，只需要有少量的底物和辅酶，就可使待测物的酶促反应产物不断扩增，扩增量决定于循环次数。反应产物增加，提高了检测灵敏度，减少了共存物质的干扰，达到高灵敏度和高特异性的要求。 产物循环-氧化酶-脱氢酶系统使用两种酶，即一种氧化酶作用后使底物发生氧化，氧化产物经一种脱氢酶催化其回到还原状态，促使底物和底物的氧化产物进入循环。在底物和产物循环的同时伴有H2O2的生成和NADH向NAD+的转变 （图25-1） 。 一、产物循环氧化酶脱氢酶系统 图25-1 产物循环-氧化酶-脱氢酶系统 底物循环-脱氢酶-辅酶系统中底物（或衍生物）及其氧化产物进入循环，反应循环中有一种脱氢酶和两种辅酶：辅酶硫代氧化型辅酶Ⅰ（thio-NAD+）和还原性辅酶Ⅰ（NADH）。 二、底物循环脱氢酶辅酶系统 该循环反应要求以下条件：①酶对thio-NAD+ 和NADH应有高度亲和力；②溶液pH和缓冲体系同时有利于双向反应（底物氧化和还原）；③thio-NAD+ 和NADH二者的浓度配比达最适条件。 图25-2 底物循环-脱氢酶-辅酶系统 氨循环-合成酶-脱氢酶系统是通过靶物质NH4+在NAD合成酶和Mg2+存在的条件下催化脱氨-NAD转化为NAD+，经亮氨酸脱氢酶将亮氨酸转化为氧化异己酸和NH4+同时生成NADH，生成的NH4+进入循环再次生成NADH，在340 nm测定（图25-3）。凡是代谢物在测定过程中有NH4+生成的都可以利用此法进行测定。 三、氨循环-合成酶-脱氢酶系统 图25-3 氨循环-合成酶-脱氢酶系统 酶循环测定法的优点是：①灵敏度可以随反应时间的延长而提高，并随酶在扩增反应中的用量而提高；②利用酶对底物的特异性，使测定系统简化；③利用四唑盐类的显色反应还可实现比色测定。因此，该法对体内极微量物质的测定是一种很有发展前景的方法。 第六节 酶激活与酶抑制测定的原理与方法 酶的另一特点是可调节性，它既可被某种物质激活，如金属离子等，也可被一些物质抑制，如氨茶碱等。据此，人们设计了酶激活与酶抑制测定法，用于人体生化物质的测定。 图25-4 激活剂与酶结合后恢复酶的催化活性 一、酶激活测定法 异柠檬酸脱氢酶法测定血清镁离子： 碱性磷酸酶法测定锌离子： 在检测的时候将待测物（抑制剂）加入反应体系，此时酶的活性被部分抑制，然后测定体系中剩余的酶的活性，通过被抑制的酶的活性即可以计算出标本中待测物的含量（图25-5）。 二、酶抑制测定法 图25-5 抑制剂与酶结合后抑制酶的催化活性 例如有机磷的酶法测定：有机磷是乙酰胆碱酯酶的抑制剂，用标准乙酰胆碱酯酶与标本在37℃孵育10 min，测定剩余的乙酰胆碱酯酶的活性，从被抑制的乙酰胆碱酯酶的活性可以计算出标本中有机磷的含量（图25-6）。 图25-6 有机磷抑制胆碱酯酶的活性 小 结 酶法分析是以酶为试剂测定酶促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及酶偶联法测定酶活性等的一类方法。 代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测定人体內的代谢物或代谢产物的技术。 酶法分为平衡法和速率法。 平衡法是指标本中待测物经过酶促指示反应信号达到平衡，测定底物的总变化量。该法的关键是要确定达到平衡所需的时间。 速率法的关键是如何使酶促反应成一级反应。 在实际应用中速率法可用固定时间法代替，只要此期间待测物消耗 5%，则测定两个固定时间的吸光度差值，就可以采用标准浓度对照法计算样本浓度。 小 结 代谢物酶法分析技术可以分为：酶反应前后光吸收变化测定法、脱氢酶指示系统测定法、过氧化物酶指示系统测定法、酶循环法测定和酶激活剂法测定等。 脱氢酶指示系统是以脱氢酶为指示酶的系统，测定的是辅酶Ⅰ或辅酶Ⅱ在340 nm 处的吸光度增高或下降的速率来计算待测物的浓度。 过氧化物酶指示系统是利用过氧化物酶为指示酶的系统，偶联的指示反应是Trinder反应。 酶循环法有很大的潜在发展能力，灵敏度可望达到纳摩尔级，可用于甾醇激素的测定。 小 结 * 第二十五章