PCR产物的纯化要点.pptVIP

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2017-01-22 发布于湖北
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PCR产物的纯化要点.ppt

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PCR产物的纯化要点

PCR产物的回收纯化. 实验目的学习和掌握从琼脂糖凝胶中纯化回收DNA片段的有关技术。背景知识 DNA片段的纯化：主要目的是回收得到纯的目的DNA片段，去除影响DNA连接酶活性的物质以及其它的DNA片段。纯化DNA片段的方法有多种，如：电洗脱法、从低熔点或普通琼脂糖凝胶中回收、玻璃珠纯化、柱层析以及硅胶吸附等方法。目前一些生物公司推出了直接从 PCR产物中或琼脂糖凝胶中回收DNA片段的试剂盒，有效地加快了DNA的纯化的速度。实验材料 PCR产物(1.15kb，带有BamHI、XhoI酶切位点) 酚；氯仿；无水乙醇；70%乙醇；灭菌双蒸水 TAE缓冲液(1×) 上样液(10×) 实验仪器 1、琼脂糖凝胶电泳系统 2、紫外观察分析仪 3、离心机（Eppendoff） 4、单面刀片实验步骤 1、制备1%琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。 2、在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减少凝胶体积，提高DNA回收率。注：切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。 3、将切下的凝胶放入Eppendorf管中，移入100ulTE缓冲液，使其浸没于TE缓冲液中 4、捣碎凝胶 ,-80 ℃,10min 。 5、加入等体积（各200μL )酚氯仿，盖紧，剧烈振摇。 10000rpm 4℃ 离心5分钟。 6．在一新1.5mL 离心管中加入 2.5倍体积预冷无水乙醇、1/10体积3M的醋酸钠。将步骤5的上清小心加入本步骤离心管中。颠倒数次混匀。在 -80℃,静置30min，12000rpm 4℃ 离心15分钟。 7．弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸巾上5分钟。室温下吹风干燥 8．视所分离DNA的量，以适量的TE，约10ul，溶解DNA。 9、电泳检测回收效率。试剂盒方法