第十三章免疫细胞分离与功能检测范例.pptVIP

第十三章  免疫细胞分离与功能检测及应用 目的要求 掌握：Ficoll-hypaque分层液分离PBMC的原理、方法，淋巴细胞亚群分离的原理、方法及应用，T细胞增殖试验的方法，B细胞的数量及功能的检测； 熟悉：T细胞功能的体内试验，T细胞介导的细胞毒检测的方法； 了解：淋巴细胞的纯化与亚群分离的方法、吞噬细胞的分离方法、溶血空斑试验。 第一节 免疫细胞的分离 免疫细胞的分离流程 PBMC包括：淋巴细胞、单核细胞 各种血细胞比重不同,利用密度梯度离心进行分离 常用分层液：ficoll－hypaque，percoll 　　 Ficoll分离液法是一种单次差速密度梯度离心的分离法，主要用于分离外周血中的单个核细胞。 Ficoll分层液：密度1.077±0.001 离心：密度梯度离心 分离：各类细胞按其相应密度重新分布　　 (三)磁铁吸引法 利用单核细胞具有吞噬的特性，在悬液中加入羰基铁颗粒，待单核细胞吞噬铁颗粒后，用磁铁将细胞吸至管底，上层液中含较纯的淋巴细胞群。 三、T、B细胞和T细胞亚群的分离 免疫磁珠分离法 流式细胞术分离法 其他方法 第二节 淋巴细胞表面标志的检测及亚群分类 二、B细胞表面标志及亚群亚群 第三节 抗原提呈细胞表面标志 一、T细胞功能检测 形态学检查法 3H-TdR掺入法 MTT比色法 原理： 原理:用刺激剂体外激活淋巴细胞，用蛋白转运抑制如莫能霉素阻止细胞因子分泌到细胞外，细胞内蛋白质转运方式被打乱，引起细胞因子向高尔基体积聚，用流式细胞仪便可测出淋巴细胞内的细胞因子种类，从而确定TH1/ TH2细胞的百分率。 原理: 试验方法: 同位素法 淋巴细胞（CTL）+含51Cr 的肿瘤细胞 肿瘤细胞破坏 51Cr 释放 测定γ射线 特异性抗原皮肤试验 PHA皮肤试验 溶血空斑试验 酶联免疫斑点试验 体内试验 刺激体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌等。 将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分别采血，分离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内B细胞的功能。 ☆斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞 ☆动物的巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取 聚合物加速沉降法 可从外周血中分离出白细胞 吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。 （一）中性粒细胞功能检测技术 （二）巨噬细胞功能检测技术 细胞趋化功能的检测 吞噬功能的检测 杀菌功能的检测 体内试验法：皮肤窗法 体外试验法：滤膜渗透法 琼脂糖平板法 原理及技术要点 在一特制的分上下两层的小盒，将趋化因子加入下室，待检细胞加入上室，两室用微孔滤膜分隔，37℃温育数小时后，上室的中性粒细胞受下室趋化因子的吸引，由滤膜微孔进入滤膜内，取滤膜清洗、固定、干燥、染色和透明，在高倍镜下观察细胞穿越滤膜的移动距离，从而判断其趋化功能。 显微镜检查法 NBT还原试验 方法： 炭粒廓清试验 正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90％炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10％炭粒。据此给小鼠静脉注射定量印度墨汁（炭粒悬液），间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。 Mф +CRBC 无 有或无 有或无 伪足 无 有或无 有或无 浆内空泡 极少、天青色 增多、嗜碱 增多、嗜碱 胞质、着色 无 无 有或无 有丝分裂 无 有或无 清晰、1～4个 核仁 不增大、密集 增大、疏松 增大、疏松 核大小、染色质 6～8 12～16 12～20 细胞大小(直径μm) 淋巴母细胞 过渡型 未转化的淋巴细胞 转化的淋巴细胞 未转化和转化淋巴细胞的形态特征 刺激物 37℃56h G1期→ S1期 合成DNA↑ 3H-TdR 37℃16h DNA- 3H-TdR 测淋巴细胞内放射量（cpm） 计算SI 判断淋巴细胞转化程度 外周血（T）G0期 3H-TdR掺入法 评价：该方法敏感性高、客观性强、重复性好、可自动操作；设备昂贵、放射污染。 刺激指数（stimulating index，SI ） SI=试验管cpm均值/对照管cpm均值 3H-TdR掺入法 放射性测定 3H-TdR 丝裂原（抗原）刺激 淋巴细胞转化试验原理示意 3H-TdR摻入法 淋巴细胞内细胞因子检测 （二）T细胞分泌功能检定 IL-2 ++