从噬菌体展示随机肽库中淘选多肽药物-北京大学教务部.docVIP

从噬菌体展示随机肽库中淘选多肽药物 Selection of Peptide drugs from Phage-displayed Random Peptide Library 生命科学学院99级 沈抒殚 摘要 以凝血酶为靶分子，利用噬菌体展示和亲和淘选技术，从随机十五肽库中筛选到结合凝血酶的3个特异结合肽克隆，并对其中结合活性最强的短肽进行了序列测定。ELISA鉴定结果表明，3个克隆对于凝血酶都有一定的结合能力，且都与凝血酶的天然抑制剂水蛭素产生竞争。 关键词：噬菌体展示，随机肽库，淘选，凝血酶 Abstract Thrombin as target molecule, and with the new bio-technique of phage display and biopanning, 3 special binding peptide clones were selected out from a phage-displayed random 15-peptide library. The sequence of the clone, which had the highest affinity with thrombin, has been determined. Data of ELISA showed that all the three clones could be combined to thrombin to some extent. And all of them could compete with hirudin, which is the natural inhibitor of thrombin. Key words: phage display, random peptide library, biopanning, thrombin 前言 噬菌体展示随机多肽库 噬菌体展示随机多肽库技术是以噬菌体展示技术（phage display）为基础的。1985年由Smith[1]首次通过基因工程手段将外源蛋白质与噬菌体的次要外壳蛋白pⅢ形成融合蛋白展示于噬菌体颗粒表面，可保持相对独立的空间构象和生物活性，而不影响重组噬菌体对宿主菌的感染能力。与其他基因表达系统相比较，噬菌体展示技术的最大特点就是它有效地将被展示多肽或蛋白质和基因偶联起来，构成一个实体，因而在得到某种多肽结构的同时也就获得了它的基因。 pⅢ蛋白因其序列中含有SGGG或SGGGG的重复而具有空间结构的灵活性，因此更适于在N端展示目的蛋白而不影响其空间结构。pⅢ位于丝状噬菌体尾端，具有识别和吸附大肠杆菌性菌毛的功能，为解决融合蛋白失去感染能力这一问题，常采用噬菌质粒和辅助噬菌体双基因组系统。噬菌质粒中pⅢ基因与外源基因融合，辅助噬菌体M13KO7中的pⅢ基因为野生型。当噬菌体颗粒组装时，噬菌质粒DNA被优先包装，这时组装好的噬菌体外壳有一拷贝的pⅢ融合蛋白，其余为野生型pⅢ蛋白，称为单价展示。单价展示时噬菌体感染能力不受影响，而且有利于淘选出高亲和力的目的重组噬菌体。 在丝状噬菌体pⅢ 基因一侧插入特定长度的随机寡核苷酸，从而在噬菌体表面展示与pⅢ融合的随机多肽；由于每一个噬菌体呈现一种序列的外源多肽，那么展示特定长度各种不同序列外源多肽的噬菌体集合体就构成一个完整的随机多肽展示库。本实验室利用改建的噬菌体展示载体pCANTAB5G8构建了噬菌体展示随机十五肽库。拟从中淘选靶蛋白的结合多肽。 亲和淘选 表达于噬菌体表面的融合多肽或蛋白质能被特异性的抗体识别。如果将某种抗体包被于固相载体，就可将表达有相应抗原的噬菌体克隆从众多的噬菌体中分离纯化出来，且抗原的氨基酸序列又可以通过对噬菌体重组体的DNA测序而获得。按照同样原理，可以分离到蛋白质特异结合的配体。随机多肽展示库的出现充分利用了噬菌体展示技术的特点和优势，以生物合成肽库来实现化学合成肽库的功能和用途，并且更加经济和便利。近10年来，大量的研究小组利用噬菌体展示随机多肽库技术构建了不同种类的噬菌体展示多肽库，并从中筛选到不同靶物质结合的多肽，使该技术在多个研究领域得到广泛应用。 噬菌体展示随机肽库的筛选是一个亲和纯化（affinity purification）200.0g polyethylene glycol 8000 146.1g NaCl 溶于1LH2O中，0.22um滤膜过滤除菌。 邻苯二胺(OPD)底物缓冲液: 2.84g Na2HPO4·7H2O 2.10g Citric Acid 溶于100mlH2O中，pH5.0 M9培养基平板的配制： 瓶1： 0.6g