酶切与连接要点.ppt

酶切与连接 限制修饰系统简称 R/M系统 restriction modification 类似于免疫体系，他能够识别自己的DNA和外来的DNA，并使外来的DNA降解。 由两种酶来控制：修饰的甲基转移酶和核酸限制性内切酶。 当外源的含有限制性酶特定位点的核酸进入细胞时，相应的核酸限制性酶就会将其解。但是菌体内的很多核酸也同样含有这样的序列，这时特异的甲基化酶就起作用了。甲基化酶在内源的部分核酸还没被限制以前就被甲基化了，这种甲基化核酸序列是限制性酶无法作用的。 2．Ⅱ型限制性内切酶的基本特性 Ⅱ型限制性内切酶的识别序列通常由4~8个碱基对组成，它们具有二重旋转对称轴，这些碱基对的序列呈回文结构。所以限制酶切割DNA后，均产生含5`磷酸基和3`羟基的末端。限制酶作用所产生的DNA片段有以下两种形式： （1）形成黏性末端 不在识别序列的对称轴上切割，而是交错切割结果形成的DNA限制片段具有黏性末端。 例如，Hind Ⅲ切割结果形成5`单链突出的粘性末端；而Pst Ⅰ切割结果却形成3`单链突出的粘性末端。 （2）形成平末端 有些限制酶在识别序列的对称轴上切割，形成的DNA片段具有平末端。例如HpaⅠ切割结果形成平末端。 Hind Ⅲ的识别序列是： HpaⅠ的识别序列是： 5`…A ↓ AGCT T…3` 5`…G ↓ TTAA C…3` 3`…T TCGA ↑ A…5` 3`…C AATT ↑ G…5` （3）限制片断末端的连接作用 许多种限制酶切割DNA分子形成的短片断能够自发的重新环化起来。如果环化分子加热后又会重新线性化。但是，如果马上使用连接酶处理，使他们的3－OH基团和5—P基团之间封闭起来，环化就是永久的了。 连接分为：分子间连接和分子内连接。 同裂酶和同尾酶 同裂酶是指一些来源不同的限制酶识别位点和切割位点的核苷酸靶序列完全一样。产生同样的切割，形成同样的末端。 同尾酶对应一类限制酶，他们虽然来源各异，识别的靶序列也各不相同，但都产生相同的粘性末端。但两种同尾酶切割形成的DNA片段经连接后所形成的重组序列，不能被原来的限制酶所识别和切割。 例如:BamHⅠ和Bgl Ⅱ BamHⅠ的识别序列和切割位点： G↓GATC C C CTAG↑C Bgl Ⅱ的识别序列和切割位点： A↓GATC T T CTAG↑A 3. 影响核酸限制性内切酶活性的因素 （1）DNA 纯度 （2）DNA甲基化的程度 （3）酶切消化反应温度 （4）DNA的分子结构 （5）限制性内切酶的缓冲液 （1）DNA 纯度 污染在DNA制剂中的某些物质，例如：蛋白质、酚、酒精、异丙醇、EDTA、高盐离子等。所以 在纯化过程中，空摔一定要时间充足，要彻底； 用微碱的TE洗脱； 提高限制内切酶的用量； 延长酶切时间； 扩大酶切体积，使潜在的抑制因素被相应的稀释。 （2）DNA甲基化的程度 核酸限制性内切酶是原核生物限制－修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，会强烈的影响酶的活性。通常从大肠杆菌细胞中分离的质粒DNA，都混有特定核苷酸序列的甲基化酶： 1 Dam甲基化酶，催化GATC序列中的腺嘌呤残基甲基化。 2 Dcm甲基化酶，催化cca\tgg序列中内部的胞嘧啶残基的甲基化。 所以在基因克隆中是使用了失去甲基化酶的大肠杆菌制备质粒DNA。 (3 )酶切消化反应温度 酶切标准温度是37℃，但是某些特殊的酶最适合温度是例外的，比如SmaⅠ是30℃。 过高或者过低的温度会使内切酶失去活性。 （4） DNA的分子结构 DNA分子的不同构型对限制性内切酶的活性也有很大的影响。当DNA分子为线性的时候最容易，当DNA分子存在二级结构的时候，酶切的活力就会大大降低。 （5 ）限制性内切酶的缓冲液 缓冲液一般的组成部分包括：氯化镁、Tris-Hcl,巯基乙醇或者二硫苏糖醇（DTT），牛血清蛋白（BSA）等。 适合的二价金属离子浓度,通常为Mg离子。 适合的PH 通常为7.4左右。 限制性内切酶的星号活性 Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都是有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称的二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶右上角角一个星号表示，因此第二活性又称星号活性