高等植物DNA提取概论.pptVIP

实验七 高等植物DNA的提取 一、实验目的 二、实验原理 植物细胞的DNA主要存在于细胞核中，称为核DNA或染色体DNA，细胞质中也有少量的DNA，主要分布在线粒体核叶绿体内，称为核外DNA。细胞内的各种DNA称为总DNA。 目前植物DNA的提取方法主要有: SDS法（十二烷基磺酸钠） CTAB法（十六烷基三甲基溴化铵） 植物细胞有细胞壁，在提取核DNA时首先要破坏细胞壁和核膜。 采用加石英砂与植物材料共同研磨的方法来破坏细胞壁； 用SDS（十二烷基磺酸钠）破坏细胞膜和核膜，并且使蛋白质变性，使蛋白质与核酸分离，通过离心就可以沉淀蛋白质； 为防止DNA被DNA酶降解，用EDTA（乙二胺四乙酸）可以螯合金属离子，抑制DNA酶的活性，使释放出来的DNA避免被降解； 得到的DNA溶液用Tris饱和酚反复抽提，进一步除去蛋白质和提纯DNA，最后用异丙醇沉淀DNA。 三、 实验材料，用具及试剂 （2）实验用具： 细胞提取液成分： SDS（十二烷基磺酸钠） EDTA （乙二胺四乙酸） 氯化钠溶液 50mmolL-1Tris-Hcl(PH=8.0) 四、实验方法 1、取鲜嫩的菠菜（去叶脉，留叶肉）50克，洗净后剪碎，放入研钵中于冰箱内冷冻10小时。（目的使材料易于研磨） 5、取上清液转入另一个离心管中，加入饱和酚定容至1 毫升。在混匀器上混匀，12000转/分钟离心5分钟。 离心管分为3层。 6、吸取上清液转入另一个离心管中，加入饱和酚，定容至1毫升，混匀，于12000转/分钟离心5分钟。 注意事项 （1）叶片磨得越细越好 （2）注意移液器的规范使用 （3）加药品顺序不要颠倒 （4）苯酚、异丙醇有毒，请小心操作！ 方法简析： 冷冻和研磨，使细胞核破裂 加入提取缓冲液，溶解DNA 饱和酚抽提，去除蛋白 加入异丙醇，沉淀DNA 酒精冲洗，去除剩余杂质 五、作业 记录实验结果并进行分析。 * 2、掌握从植物组织中提取核DNA的一般原理和操作 过程，为以后基因工程的研究奠定基础。 1、了解DNA的性质。 高等植物的核DNA相对分子质量较大，与蛋白质结合成染色体，在纯水或1摩尔每升的氯化钠溶液中溶解度较大，而不溶于有机溶剂。DNA为白色类似石棉样的纤维状物。 （1）实验材料：新鲜的菠菜叶片 高速离心机 移液枪 研钵 细胞提取液，Tris饱和酚，异丙醇，石英砂 （3）实验试剂： Tris饱和酚成分： Tris-Hcl(PH=8.0) （Tris：防止酚类氧化成醌，醌破坏核酸结构） 苯酚（蛋白质变性剂，使细胞中蛋白质变性析出） 2、加入适量的石英砂研磨成匀浆状。（迅速研磨:目的是破坏细胞壁） 3、加入2倍体积的细胞提取液，轻轻混匀，装入小离心管中1毫升。于65℃水浴下放置40分钟。 4、于8000转/分钟的速度离心5分钟。上清液中含有DNA， 沉淀中有蛋白质，大的碎片等。 7、吸取上清液，加入异丙醇定容至1毫升，混匀(切勿在混匀器混匀，颠倒混匀），12000转/分钟离心5分钟。 8、弃上清液，用乙醇冲洗DNA。 细节决定成败！！！ 1.设定体积 移液枪的使用： 2.装枪头 3.吸液 3.1 垂直吸液，枪头尖端需进入液面2-4mm以下。 3.2 吸液时打到第一档吸液。 3.吸液 4.放液 4.3 4.1 4.2 4.4 4.5 4.3 5.使用完毕