双糖对猪精子冷冻保存效果的影响.docxVIP

双糖对猪精子冷冻保存效果的影响?潘红梅1，2麻常胜3陈主平1，2郭宗义1，2*（1.重庆市畜牧科学院，重庆荣昌，402460；2.重庆市养猪工程技术中心，重庆荣昌，402460；3.康地恩生物科技有限公司，山东青岛，266061）摘要：本研究以不同比例的蔗糖和海藻糖替代乳糖，添加于猪精液稀释液中，比较不同双糖或双糖组合在冷冻条件下对猪精子的保护效果。结果表明，蔗糖和海藻糖部分或全部取代稀释液中的乳糖成分，对猪精子冷冻后质量均有一定程度的提高。当稀释液中添加66.7%的蔗糖代替乳糖（F组，33.3%乳糖+66.7%蔗糖）时，猪精子冻后活率达37.0±2.6，显著优于其它各组（P＜0.05），其它各项指标也显著高于单一乳糖组（A组）。本研究证明，在含有乳糖的猪精液冷冻保护液中以66.7%的蔗糖代替原配方中的乳糖量对猪精液冷冻保护的效果最好。关键词：猪精子，精液冷冻，海藻糖，蔗糖，乳糖早在1776年就有报道表明，冷冻于雪中的精子可以存活，自此，研究者们开始试图建立低温保存精子的技术，但这个过程长达200年之久。直到20世纪中叶，Polge等[1]发现甘油对精子具有冷冻保护作用后，人类才真正实现了精子的冷冻保存。甘油具有渗透性，它不但能渗入精子内部，使精子免受电解质浓度增加对精子产生的影响，它还是很好的溶剂，具有杀菌作用。但甘油的分子量较大，渗入或渗出细胞的速度较水分子慢，而且在常温下对精子的活力和受精力毒害作用较大。0llero[2]报道证实猪精子对甘油的耐受程度比其它家畜更弱，在冷冻液中加入较多的甘油会导致精子顶体膜的损伤和改变顶体膜的穿透能力。人们开始寻找其它的冷冻保护材料，以替代或降低甘油在猪精液冷冻保护液中的添加量。近年来，非渗透性冷冻保护剂成为研究的热点。非渗透性冷冻保护剂又称作细胞外冷冻保护剂，能溶于水，但不能进入细胞，这类冷冻保护剂主要是由葡萄糖为代表的单糖和以海藻糖、乳糖和蔗糖为代表的双糖类组成。这些糖类物质除了能为精子提供能量底物，维持溶液渗透压外，它们还能诱导胞外冰晶网格以及水分子笼型结构的形成，在冷冻过程中稳定细胞膜，保护细胞免受机械损伤，防止因极度脱水引起膜的损伤。海藻糖、乳糖和蔗糖作为非渗透性冷冻保护剂的双糖代表，能够提高细胞外渗透压，在冷冻过程中使细胞内的水分向细胞外渗出，引起细胞脱水而皱缩，减少细胞内冰晶形成，从而保护细胞免受破坏。C.Ytldtz[3]等人研究证明，糖的类型能够明显影响精子冻后结果，稀释液中添加同一类型的多种双糖能够提高精子冻后顶体完整率。本研究拟以前期实验[4]中筛选出的猪精液冷冻保护剂配方为基础，用不同浓度的蔗糖和海藻糖替代稀释液中原有的乳糖量，比较不同双糖或双糖组合对猪精子的保护效果。1材料和方法1.1精液采集精液来源于重庆市畜牧科学院育成的渝荣I号配套系公猪。手握法收集5头繁殖历史清?项目基金：重庆市畜牧科学院基本科研业务费重庆市科委专项资金项目10608。作者简介：潘红梅（1979-），女，副研究员，主要从事动物繁殖研究。Email:panhm_2118@163.com。*通讯作者：郭宗义（1965-），男，研究员，主要从事动物繁殖育种研究。Email:guozongyi@。楚，健康无病成年公猪的精液。收集浓份精液，8层纱布过滤除去胶体和杂质，半小时内送达实验室。1.2精液冷冻1.2.1稀释液本次实验采用的猪精液冷冻保护基础液是本实验室前期实验中筛选出的配方[4]，其配方组成为：葡萄糖2.1g、乳糖3.0g、甘氨酸0.8g、柠檬酸三钠0.3g、青霉素10万IU、链霉素10万IU、蒸馏水100mL配成基础液，在基础液中加入20%的卵黄，配成冷冻稀释液Ⅰ液；向冷冻稀释液Ⅰ液中添加3%的甘油，即为冷冻稀释液Ⅱ液。向I液中添加不同比例的海藻糖和蔗糖替代乳糖的添加量，组成七组不同的冷冻基础液，即A组（乳糖100%，即3.0g/100mL），B组（乳糖66.7%+海藻糖33.3%），C组（乳糖33.3%+海藻糖66.7%），D组（海藻糖100%），E组（乳糖66.7%+蔗糖33.3%），F组（乳糖33.3%+蔗糖66.7%），G组（蔗糖100%）。1.2.2冷冻精液送回实验室后立即对精液的容积、密度和活率进行检测，活率达0.7以上的精液可用于冷冻。实验采用两步稀释法稀释精液，具体操作如下：精液在34℃下静置1h左右，使精子与精清充分接触后，以1000×g离心10min，除去上清液。等比例加入冷冻稀释液Ⅰ液，充分混匀后用8层纱布包裹，置于4℃冰箱中平衡2h，使之缓慢降温至2～5℃，同时将配制好的冷冻稀释液Ⅱ液放入冰箱与精液一起平衡。第一次平衡后，再加入等比例的冷冻稀释液Ⅱ液，使精液最终稀释比例为1:3，继续平衡1～2h后，然后开始滴冻。用液氮熏蒸法制作颗粒冻精。在大小适中的泡沫盒中注入2/