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生化实验一-lowry法测Pr含量[精选]
生物化学与分子生物学系 杨 芬 实验室规则 按规章操作,保障实验安全; 进入实验室要着白大衣;禁止进食和饮水 禁止大声喧哗,保持实验环境的安静; 维持实验室的整洁。 实验分组 实验室卫生 实验报告的书写 实验名称 姓名: 班级: 学号: 实验原理: 实验目的: 实验步骤:文字简洁,尽可能采用图表 实验结果:原始数据、计算过程、结论 实验讨论:结果分析、实验注意事项 实验日期: 同组人员: 实验报告的书写 一、玻璃仪器的常规清洗 二、试剂瓶、吸量管、试管的放置 基 本 操 作 三、刻度吸量管的使用 四、微量移液器的使用(加样枪) 一、玻璃仪器的常规清洗 二、试剂瓶、吸量管、试管的放置 1、清洗剂洗刷 2、自来水冲洗3-5 遍 3、蒸馏水冲洗2-3 遍(2-3ml/次) 4、倒扣放置 1、试剂瓶用后放回原处、标签面向自己 2、吸量管尖头朝下放置,以免倒流 3、空置干净试管倒扣放在试管架上 选、吸、平、减、吹 三、刻度吸量管的使用 四、微量移液器的使用(加样枪) 单通道数字可调式移液器 多通道手动可调式移液器 1、看清加样枪规格。 2、仔细调节旋钮至所需刻度。 3、安装枪头。 4、压至一档,吸取溶液。 5、放出溶液:压至二档。 实验一 改良Lowry氏法测定蛋白质含量 蛋白质常用的定量方法 1.凯氏定氮法 2.紫外吸收法 3.呈色法 双缩脲法 酚试剂法 一、实验目的: 1、学习改良Lowry氏法测定蛋白质含量的原理及方法 2、了解标准曲线在物质定量测定中的应用及绘制要点 二、实验原理 : Pr Cu2+ OH- Pr-Cu2+ 螯合物(紫红色) 酚试剂 钼蓝-钨蓝混合物 (蓝色) (双缩脲反应) 优缺点 缺点:费时较长,而且要精确控制操作时间。 显色程度与时间有关。 专一性较差,干扰物质较多。 酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油以及含有巯基、酰胺基、伯胺基的化合物等均可干扰。 优点:灵敏度高 双缩脲法的检出限为0.2~1.7mg/ml, 而本法的检出限为0.015~0.110mg/ml。 三、实验步骤: 标准曲线的绘制及样品测定 试剂 (ml) 标准曲线绘制 样品 测定管 0 1 2 3 4 5 Pr标准液 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 待测血清1.0 生理盐水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 试剂A 0.9ml, 混匀后,37℃水浴10min 试剂B 0.1ml, 混匀后,室温放置10min 试剂C 3ml, 立即混匀,37℃水浴10min 分光光度计以波长650nm依次比色读取光密度值 分光光度计 分光光度计的原理 分光光度计的操作 拉杆,1-4档 样品池 读数 波长 光 源 I0 I 单色器 样品池 狭缝 检测系统 分光光度计的构造 T = I/I0, A = - lg T Lambert-Beer 定律 A = KcL 分光光度计的原理 I0 I L K:吸光系数 c:溶液浓度 L:溶液厚度 c A标/A测= c标/c测 A:吸光度 T:透光度 2. 标准曲线法 分光光度计的使用 1、打开分光光度计,预热20-30min。 2、调节旋钮至需要的光波长。 3、检查拉杆是否在分光光度计的休息状态。 T档 拉杆1档 空白管 调T 100% : T档 拉杆1档半 调T 0% : A档 拉杆2、3、4档 测吸光度 标准管,测定管 休息状态:拉杆1档半 四、结果: 1、标准曲线的绘制和实测样本浓度的求得 实测Pr含量 2、浓度换算 待测蛋白浓度(g/L)=实测Pr浓度×稀释倍数 五、注意事项: 1、测定管蛋白浓度应在0.015-0.110mg/ml; 2、各管加试剂C必须快速,并立即摇匀,不应出现混浊; 3、精确控制操作时间。 * * * * * * * *
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