生物化学和分子生物学七年制实验一[精选].ppt

生物化学和分子生物学实验 1 必须穿白大褂； 2 书包放在实验台的上层架子上； 3 实验报告在实验课后24小时内由组长统一上交； 值日生注意事项强调： 1 清洁实验台上层架子； 2 用湿抹布擦黑板； 3 清洁比色皿； 4 将所有移液枪调到最大量程。 第一节 分光光度法(Spectrophotometry) 定义： 根据物质对光的吸收特性和吸收强度，对物质进行定性和定量的分析方法。 溶液的颜色 互补色 光 可见光 光的吸收定律 A=KLC C：物质的浓度， g/L mol／L L：光程，cm， K：吸光系数 摩尔消光系数ε：当溶液浓度为lmol／L，光程为1cm时所测得的一定波长下的吸光度。 百分比吸光系数K：当溶液浓度为l00g／L，光程为1cm时所测得的一定波长下的吸光度。 吸光系数只与物质的性质和入射光的波长有关。 波长的选择 波长的选择一般是选择待测物质最大吸收峰的波长(λmax) 1．应使被测溶液有适当的光密度，适当的光密度为0.1—0.7，而以0.2—0.6最理想。 2．应使干扰影响降低至最低限度。 3．应使标准曲线在尽可能大的范围内接近直线。 待测溶液浓度的计算 1.利用标准管法计算待测溶液的浓度 2.利用标准曲线进行换算 3.利用Lambert—Beer定律 计算 A=KLC C=A/KL 利用标准管法计算待测溶液的浓度 实验步骤 实验记录 公式计算法求蛋白质浓度 1．标准曲线的作用 (1) 从浓度一 光密度直线的直线特性，可以判断所采用方法的呈色反应是否符合Lamben—Beer氏定律。 (2)作多次平行测定绘制标准曲线，可判断在整个测定过程中操作，仪器等误差的大小，从而确定该测定方法的可靠性。 (3)从绘制标准曲线的斜率可以比较各种方法的灵敏度。 (4)当进行大批样品分析时，可省略多次计算，从光密度值直接查阅标准曲线而求得被测物质的浓度。 2．标准曲线的作法 (1)标准液浓度的选择：标准液浓度选择一般应能包括待测样品的可能变异最低与最高值，一般可选择5种浓度。浓度差距最好是成倍增加或等级增加。 (2)标准液的测定：在比色时，读取光密度至少读2—3次，求其平均值，以减少仪器不稳定而产生的误差。 实验步骤 3.标准曲线图的绘制： ①用普通方格纸作图。以横轴为浓度，纵轴为光密度。 ②若各点不在一直线，则可通过原点，尽可能使直线通过更多点，使不在直线上的点尽量均匀地分布在直线的两边。 ③标准曲线绘制完毕以后，应在座标纸上注明实验项目的名称，所使用比色计的型号和仪器编号、滤光片号码或单色光波长以及绘制的日期、室温。 ⑷绘制好的标准曲线只能供以后在相同条件下操作测定相同物质时使用。 绘制标准曲线 第二节 蛋白质定量分析 蛋白质定量分析即蛋白质溶液的浓度测定； 现实应用：1. 临床检测——血清蛋白浓度测定；2. 科学研究——纯化蛋白的浓度测定； 主要方法 根据蛋白质元素组成——凯氏定氮法； 根据蛋白质组成特点建立的比色法——双缩脲法，lowry改良法，考马斯亮蓝染色法，BCA法； 根据蛋白质的吸收特性建立的紫外分光光度法； 双缩脲法 实验步骤 蛋白质的紫外吸收 实验步骤 BCA测定蛋白质浓度 在碱性条件下蛋白质与二价铜离子Cu2+络合，并将其还原成一价铜离子Cu1+。 Cu1+和BCA试剂反应, 形成稳定的紫蓝色复合物。 反应所生成的复合物，在562 nm处有强烈的光吸收，且吸光值和蛋白质浓度在广泛范围内有良好的线性关系，可用于蛋白质浓度的测定。 双缩脲法：540nm，玻璃比色杯，vis-7220 紫外法：260，280nm，石英比色杯，uv-9200或者uv-9600或者uv-2000。调节不同波长时需要再次调零 BCA法562nm，用0.5cm的比色杯，同时应特别注意，BCA法的标准品与双缩脲和紫外法的不同 双缩脲与BCA需做标准曲线。紫外法不需做标准曲线。 实验报告 一 原始记录 记录实验所获得的原始数据。 实验报告 将原始记录置于第一页，装订一同上交。 实验原理（清晰） 实验步骤（简略但清晰） 数据处理（数据带入的过程，若为定性实验则为观察到的现象） 实验结果 实验讨论（讨论实验成败的原因，实验可改良的地方等） 双缩脲测定蛋白质浓度计算 紫外分光光度法测定蛋白质浓度 实验一 蛋白质定量分析技术 双缩脲法 紫外分光光度法 BCA（二喹啉甲酸）法 Lowry法(Lowry改良法) 考马斯(Comessie)亮兰结合法 凯氏定氮法 一、双缩脲法测定蛋白质含量 【原理】 双缩脲(NH2CONHCONH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应。 蛋白质分子中含有许多肽键(-CONH-)在碱性溶液