western-blot原理及操作流程1116重点.ppt

杂交需要试剂－底物 显色底物：操作简单，灵敏度低，如TMB、DAB、BCIP/NBT 化学发光底物：灵敏度高，需要曝光检测设备（暗室、曝光设备和胶片）或者凝胶成像设备。 结果分析 使用Photoshop 检测灰度值 使用graphpad做柱状图 WB常见问题 没有信号 高背景 非特异性条带 条带大小不对 标本问题 标本中不含检测蛋白：设置阳性对照 上样量不够，或者蛋白表达丰度比较低：增加上样量 转膜问题 转膜不完全：转膜后使用丽春红染色，确定目的大小蛋白条带是否存在于膜上，使用蛋白质Marker. 洗涤过度：减少洗涤时间和次数. 封闭 封闭过度：减少封闭试剂浓度，封闭时间，更换封闭试剂 抗体孵育和检测 抗体浓度和时间孵育不够：增加抗体浓度，延长孵育时间 一抗不工作：设置阳性对照 二抗不工作：和其他一抗配合检测二抗是否工作 一抗/二抗不匹配：检查抗体的来源和亚型。正确选择二抗 底物失活：重新配制有效的底物 没有信号/弱信号 背景高 封闭 封闭时间不够：延长封闭时间 优化封闭试剂的类型和浓度 封闭试剂和抗体有交叉反应：更换封闭试剂. 磷酸化抗体不能使用含有酪蛋白的封闭试剂：推荐BSA封闭 抗体孵育和检测 一抗/二抗浓度太高：降低抗体浓度 孵育温度太高：建议4度孵育过夜 其他 洗膜不充分：5*3mins，多次短时间的洗膜 曝光时间过长：缩短曝光时间 出现干膜现象：保证膜充分浸透，避免出现干膜 二抗非特异性：设置只加二抗对照 非特异性条带 标本制备 二聚体或者多聚体：增加上样前煮沸变性时间 蛋白不同剪切体或者 isoforms 存在. 蛋白降解：使用新鲜制备的标本，标本中加入新鲜配制的蛋白酶抑制剂 上样量过大：减少上样量 封闭Blocking 封闭不充分：优化封闭时间和封闭试剂浓度 抗体孵育和检测 一抗/二抗浓度过高：降低抗体浓度 抗体没有经过纯化 二抗非特异性结合：使用二抗对照 其他 洗膜保证充分 * * * * * 比如，如果一抗是小鼠IgG来源的抗体，二抗需选择抗小鼠IgG的；如果一抗是小鼠IgM来源的抗体，则二抗要选择抗小鼠IgM的。 * 专业生产底物的公司，在全球占有很大的市场。无论是化学发光还是显色的底物。具有很高的性价比 2016-11-16 Western Blot实验技术及常见问题分析 Western blot 定义 Western Blot中文一般称为蛋白质印迹 通过聚丙烯酰胺电泳根据分子量大小分离蛋白后转移到杂交膜上 分离的蛋白可以通过一抗/二抗复合物进行检测 是蛋白质分析的最流行的技术之一 Western blot 原理 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 Western blot 原理 Western Blot操作流程 蛋白样品的制备 （蛋白抽提、定量） SDS-聚丙烯酰胺 凝胶电泳 （SDS凝胶制备、上样） 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液 对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 细胞裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 ， 0.05% PMSF ， 2μg/mL Aprotinin, 0.5μg/mL Leupeptin ， pH8.0 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。 一、蛋白样品的制备 蛋白样品的定量(Bradford法 ) 原理—考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。 制作标准曲线 （插入表格） 检测样品蛋白含量：取一管考马斯亮蓝+95 ?l 0.15mol/L NaCl NaCl溶液+5?l待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入比色杯中测试。 目前世界上最常用的蛋白浓度检测方法是： BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCA?Prot