精选课件第二篇：生物化学分析的常规方法.ppt

第二章：生物化学分析的常规方法 生物化学实验设计过程 生物化学分析方法 主要生物物质分析（含量和活性测定） 实验材料的选择与处理 目的物的提取与分离 生物物质的浓缩、干燥、保存及纯度鉴定 一、生物化学实验设计过程 生物化学实验的化学过程 生物化学实验的物理过程 实验方法的组合 生物化学实验过程的设计 二、 生物化学分析方法 生物化学分析的目的：测定一定供试样本中某类或某种生化物质的含量或活性。 1.重量法 2.化学法 3. 分光光度法 三、 主要生物物质分析 四、实验材料的选择及预处理 生物大分子活性物质的存在方式和存在特点 实验材料的选择和要求 材料的预处理 生物组织与细胞的破碎 1、 生物大分子活性物质的存在方式及存在特点 （1）存在部位和分布方式：存在部位一般与生物学功能相关，分布方式则一般被分为“胞内”和“胞外”。 生物大分子分离纯化的一般步骤 2、 生物材料的选择和预处理 生物材料的选择主要考虑：来源，价格，目的物含量，杂质的种类、数量和性质等。 （2）材料采集、保存和预处理 一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。 植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。 细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。 五、目的物的提取与分离 5. 核酸分析（核酸含量测定） 核酸含量的测定 紫外吸收法 二苯胺法（DNA） 地衣酚法（RNA） 定磷法 植物材料中DNA的提取：CTAB法 动物材料中DNA的提取：氯仿－异戊醇法 灰分测定：重量法 6. 矿物质分析 灰分测定 矿质元素测定 主要步骤：样品称重→碳化→灰化→恒重→含量计算 矿质元素测定（定性定量分析） 主要过程：样品消化→酸化→测定 测定仪器 原子吸收分光光度计 等离子发射光谱 8种元素（Ca、Fe、K、Mg、Mn、P、Zn、B）可实现定量，18种元素实现半定量。 酶的提取及活性测定： 酶在提取时通常使用缓冲液提取并需加入保护剂和稳定剂。 酶活性测定方法：多种，常用比色法 （试剂盒的应用）。 维生素测定方法：比色法、滴定法、仪器法等 （2）存在的特点： 生物活性物质在生物材料中含量较低，且生理活性越高的成分，含量往往越低。 生物材料中的生化组成数量大、种类多，目的物与众多杂质理化性质十分接近，所以分离、纯化比较困难。 生物大分子活性物质的结构和理化性质不同，所以分离纯化方法不同，不可能有统一的标准方法。 沉淀技术 离心技术 膜分离技术等 │←前处理→│←粗分级→ │ ← 细分级 →│ ← 浓缩干燥→│ 材料选择与处理 细胞破碎及目的物的提取（机械破碎、溶账和自溶、酶解、化学处理） 原料的选择和预处理→生物组织与细胞的破碎→从生物材料中提取有效的活性物质→有效成分的分离纯化→后处理及制剂 离心技术 电泳技术 层析技术等 化学法 物理法 一般选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上注意选择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低的动植物组织或微生物做原料。科研选材则无需考虑上述问题，只要能达到实验目的即可。 材料选择基本原则：有效成分含量高，来源丰富易得，材料新鲜，目的物易与非目的物分离，所取样品具有均匀性和代表性。 （1）材料的选择 材料采集：要求新鲜、快速、完整、尽量不带入其他组织，符合卫生条件，无微生物污染和有害物质等。 材料保存方法：速冻、冻干、有机溶剂脱水、制成“丙酮粉”、快速干燥等。 预处理 动物材料:去结缔组织、脂肪组织等。 植物材料:清洗、去壳、杀青等。 微生物材料:固液分离等 动物样品预处理：清洗→去结缔组织、脂肪组织等→绞碎、匀浆→脱脂→冷冻处理（液氮或超低温保存）。 植物样品预处理： 制备“丙酮粉” 种子样品的处理：去杂质→研磨或粉碎→过筛（80-100目）→混 匀保存（长期保存需蜡封并放入少量樟脑或二氯甲苯等）。 根、茎、叶、果实样品的处理： 干样制备：净化→杀青（105℃，15-20min）→烘干（70-80 ℃ ，8-12h）或凤干→粉碎→过筛→混匀保存。 鲜样：用于酶活性测定，某些化学成分含量测定的等。 及时测定；液氮或超低温保存；冷冻干燥后于0-4 ℃保存；匀浆后样品可加防腐剂（甲苯、苯甲酸等）于0-4 ℃保存或超低温保存。 微生物样品预处理：主要是固液分离。最常采用的方法为离心和过滤。液体部分可在低温下短时间保存，固体则可制成冻干粉于