细胞内化学组分测[精选].ppt

细胞内化学组分测定分析技术 流式细胞技术（Flow Cytometry, FCM） 放射自显影技术（radioautography） 免疫组织化学技术 流式细胞技术（FCM） 流式细胞技术（Flow Cytometry, FCM）是利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。 流式细胞仪（Flow Cytometer）集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技技术。 流式细胞计基本结构 流式细胞计的基本结构流式细胞计主要由四部分组成。它们是： 流动室和液流系统； 激光源和光学系统； 光电管和检测系统； 计算机和分析系统。 原理 　待测样品(如细胞、染色体、精子或细菌等)经荧光染料染色后制成样品悬液，在一定压力下通过壳液包围的进样管而进入流动室，排成单列的细胞，由流动室的喷嘴喷出而成为细胞液流，并与入射激光束相交。细胞被激发而产生荧光，由放在与入射的激光束和细胞液流成 90°处的光学系统收集之。光学系统中的阻断滤片用于阻挡激发光；二色分光镜及另一些阻断滤片则用于选择荧光波长。荧光检测器为光电倍增管。散射光检测器是光电二极管，用以收集前向散射光。小角度前向散射与细胞大小有关。 激光光源 光收集系统：滤光片 光收集系统：光电倍增管 液流系统：流动室、液流驱动系统 细胞分选系统 应用举例 流式细胞术在细胞生物学、分子遗传学、微生物学、免疫学、分子生物学以及临床肿瘤学、临床血液学等诸多领域都有广泛应用 ： 1.在细胞生物学方面的应用 细胞生物学是FCM应用最广泛也是最基本的领域，细胞周期分析是其基本分析内容之一，而实施的技术途径是通过测定细胞周期各时相的DNA含量来达到的 。 2．在免疫学方面的应用：　 FCM以它的快速、灵活及定量的特点被广泛地应用于免疫学的基础研究和临床应用的各个方面，尤其是结合单克隆抗体技术，在免疫分型、分选、肿瘤细胞的免疫监测、机体免疫状态的监测、免疫细胞的系统发生及特性研究等方面更能起到重要作用，成为现代免疫技术的重要组成部分。基于免疫技术是免疫细胞化学分析技术的基础，我们着重介绍FCM在免疫应用中的技术问题。 3.在遗传学研究的应用： 　 用流式细胞术测定染色体DNA含量,可得到染色体频率分布图，称为流式染色体核型分析。同类型染色体出现一个峰，峰的面积代表这种类型染色体的丰度。流式染色体核型分析技术不仅能快速分析核型，而且能分选出不同类型的染色体,做成人类每条染色体的DNA文库，可用于人类基因组研究、遗传病和癌症的诊断的研究。 4．在肿瘤学研究的应用：　 肿瘤细胞一般都含有异常数量的 DNA。在大多数实体瘤和急性白血病中都发现有非整倍体的细胞，由于流式细胞术样品制备方法简单，测定结果精确，能快速得到有关DNA倍性的信息,因而能提供有价值的诊断数据。如果在测量 DNA含量的同时，再测定其他参数（如不同类型的中等纤维蛋白，蛋白质含量、细胞大小、核质比等）则可进一步提高诊断的可靠性。 。 此外，流式细胞术在血液学、微生物学、分子生物学等领域中也得到广泛的应用。 　　流式细胞术正在向高灵敏、高速度、多参数测量、获取形态学信息等方面发展。 放射自显影技术 放射自显影技术是利用感光材料的感光特性，使之感受放射性核素的涉嫌后，通过显影和定影而得到和标本中偶那个放射性示踪剂所在部位、强度完全一致的银粒影像的技术，所得到的图像称之为放射自显影影像。 原理 将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量，放射自显影的切片还可再用染料染色，这样便可在显微镜下对标记上放射性的化合物进行定位或相对定量测定。 1.发射电子： 核乳胶被发射源带电粒子作用 负电的卤素离子中释放电子 AgBr+β Ag++Br-+e- 离子对形成： 当电离离子通过溴化银晶体时形成许多离子对 3.银原子形成： 溴离子所发出的电子被带正电的银离子所俘获。 e-+Ag+ Ag 4.潜影形成： 俘获电子的过程，是还原过程，很多带正电的银原子被还原，在溴化银分子中形成潜影。 5.显影、定影形成： 显影：是形成潜影的卤化银晶体在显影过程中被还原成银盐颗粒，显出影像 定影：未形成潜影的晶体通过定影而溶解 用途