实验六 DNA的体外连接.pptx

实验五、DNA的体外连接一、实验目的学习DNA片段之间的体外连接方法二、实验原理DNA连接酶催化两个双链DNA片段5’端磷酸和3’端羟基之间形成磷酸二酯键。DNA连接酶主要有：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌连接酶两种。T4 DNA连接酶的底物可为：(1) 一条链带有缺口的双链DNA分子；(2) 两个存在互补粘性末端的双链DNA片段；(3) 两个存在平末端的DNA片段；(4) RNA－DNA杂合体中，具缺口的RNA和DNA分子。T4 DNA连接酶催化DNA连接的反应分三步进行：(1) 辅助因子ATP中磷酸基团与T4 DNA连接酶上的Leu残基的NH2结合，形成酶-AMP复合物；(2) 酶-AMP复合物活化DNA链5’端的磷酸基团，形成磷酸－磷酸酯键；(3) DNA链3’端的羟基活化与5’端磷酸根形成磷酸二酯键，释放AMP，完成DNA链间的连接。用于克隆的质粒载体在用单酶切酶切成线状后，一般需用碱性磷酸酯酶(CIP或BAP)进行去磷酸化处理，以防止载体自身环化，减少不含重组子的菌落产生。三、实验材料上次实验课回收的MP3酶切片段，用试剂盒抽提的pSK质粒四、仪器设备电泳仪 微型电泳槽 紫外透射检测仪 恒温金属浴 冰箱五、实验用具冰盒 微量离心管移液器 微量离心管（1.5 ml、0.5 ml） 吸管头若干六、试剂 琼脂糖 0.5?TBE电泳缓冲液 10 ? 载样缓冲液 （loading buffer） GoldView I型核酸染色剂 （10000 ? ，Solarbio） DNA分子量标准（DNA marker）：Marker III（广州东盛生物科技有限公司） 已知系列浓度的λDNA (10、20、50、100 ng/? l )（ TaKaRa） 牛小肠碱性磷酸酶（calf intestine alkaline phosphatase, CIAP, TaKaRa） T4 DNA 连接酶（T4 DNA ligase, TaKaRa） DNA凝胶回收试剂盒（广州东盛生物科技有限公司）七、实验步骤1、pSK载体的Hind III酶切2、 Hind III酶切pSK载体的脱磷3、脱磷pSK载体的回收4、目的片段和载体的定量5、目的片段和载体的连接6、准备感受态细胞制备和大肠杆菌转化用试剂和用品1、pSK载体的Hind III酶切100 ?l反应体系（1.5 ml离心管）： pSK质粒DNA 500 ng（试剂盒抽提） 酶切Buffer 10 ?l Hind III酶1 ?l 灭菌ddH2O up to 100 ?l加样顺序：水、buffer、DNA、酶37℃恒温箱酶切30 min。 2、 Hind III酶切pSK载体的脱磷在上述100 ?l酶切体系中加入： 10×CIAP buffer 5 ?l 稀释10倍的CIAP酶1 ?l （3 U）37℃恒温箱消化30 min。注：浓度高的酶可以用水和反应buffer进行稀释，稀释后的酶液应在1×的buffer里；稀释的酶先用现配，用后弃去。100 ?l稀释体系（1.5 ml离心管）： 灭菌ddH2O 80 ?l CIAP Buffer 10 ?l CIAP酶10 ?l加样顺序：水、buffer、酶 ，轻柔混匀后短暂离心收集到管底备用。 3、脱磷pSK载体的回收在上述脱磷体系中加入ddH2O 调整体积到200 ?l，然后加入等体积的BD溶液，然后利用DNA凝胶回收试剂盒从步骤5开始进行回收，最后用30 ?l的Eluent进行洗脱。4、目的片段和载体的琼脂糖凝胶电泳定量利用琼脂糖凝胶（1%）电泳法检测DNA浓度：分别取回收的MP3酶切片段、酶切和脱磷的pSK质粒、已知浓度的λ DNA各1 ? l于点样板小孔中，再加入8 ?l TE和1 ?l的10 ?载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。同时点5 ?l MarkerⅢ作为分子量标准。电泳后的目的片段和载体条带的亮度与已知浓度的λ DNA的亮度进行比较，估算出其浓度。4、目的片段和pSK载体的连接（每组同时做2个载体自连对照）10 ?l反应体系（0.5 ml离心管）： 酶切的pSK质粒DNA 10-20 ng MP3酶切回收片段10-20 ng 10×T4 DNA 连接酶Buffer 1 ?l 稀释10倍的T4 DNA 连接酶 1 ?l（35 U） 灭菌ddH2O up to 10 ?lddH2O、 pSK质粒DNA 和MP3酶切片段 混匀后先在45度热板上温育5 min使粘性末端分开，之后加入T4 DNA连接酶buffer和T4 DNA连接酶，混匀，稍离心后放于4℃冰箱中连接到下次实验。T4 DNA 连接酶Weiss单位：连接酶单位最早是1968年由Weiss提出的Weiss单位，现在也