分子克隆工具酶重点.ppt

S1核酸酶的基本特性 Ca2+ 5‘ dNMPs 或 5‘ NMPs ssDNA or RNA Ca2+ Ca2+ 5、单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶 Bal31核酸酶的基本用途：诱发DNA突变 EcoRI A B C EcoRI EcoRI B C A Bal31 B C A 环化 A C ① ?链 有反转录活性和 RNaseH活性。 RNaseH： ?链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。 以5’?3’或3’?5’方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的RNA链。 RNaseH RNA DNA RNA DNA （3）逆转录酶的用途 ② ?链 RNA-DNA杂交双链中5’?3’DNA外切酶活性。 ① 合成cDNA 以oligo dT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。 AAAAA TTTTT 5’ 3’ mRNA 5’ cDNA ② 合成DNA探针 用随机引物（random primer）或oligo dT做引物。 随机引物： 随机顺序形成的寡聚DNA片断。 （理论上它能与各种序列的模板结合） ③ RT-PCR用的模板 克隆某个基因时，用其mRNA反转录出cDNA第一链。 7. 末端转移酶 来源于小牛胸腺，是一种不依赖于模板的DNA聚合酶。 可在cDNA或载体的3’末端加同聚物尾巴，便于克隆。 末端脱氧核苷酸转移酶（TdT） 不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs 5‘ p 3‘ HO OH 3‘ p 5‘ TdT Mg2+ dATP 5‘ p 3‘ HO AAAAAAAAAAAA OH3‘ p 5‘ TdT的基本特性： 5‘ p 3‘ HO OH 3‘ p 5‘ TdT Co2+ dATP 5‘ p 3‘ HO AAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA OH 3‘ p 5‘ 5‘ p 3‘ HO OH 3‘ p 5‘ TdT Co2+ dATP 5‘ p 3‘ HO AAAAAAAAAAAAAA OH 3‘ p 5‘ AAAAAAAAAAA 第四节 其它分子克隆工具酶 一、连接酶 （1）大肠杆菌连接酶 1. 两种DNA连接酶 只能连接粘性末端。 （2）T4噬菌体的连接酶 不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。 （1）必须是两条双链DNA。 （2）DNA3’端有游离的-OH， 5’端有一个磷酸基团（P）。 （3）需要能量 动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+ 2. 连接条件 连接酶反应的最佳温度是37?C。 3连接反应的温度 最佳温度 在37℃下粘性末端的结合很不稳定。 实用温度 所以一般采用 4~16 ?C。 增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。 插入片段与载体的浓度比例 反应温度 4、影响连接反应的因素 10~20倍。 一般14~16℃ DNA连接酶 DNA连接酶的基本性质 修复双链DNA上切口处的磷酸二酯键 DNA连接酶 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ OH P OH P 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ nick nick OH P DNA连接酶 DNA连接酶的基本性质 修复与RNA链结合的DNA链上切口处的磷酸二酯键 T4-DNA连接酶 5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C … 5’ nick 5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C … 5’ DNA连接酶 DNA连接酶的基本性质 连接多个平头双链DNA分子： 5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’ 5‘ … G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C … 5’ T4-DNA连接酶 DNA连接酶 DNA连接酶的反应条件 Tris-HCl 50 - 100 mM pH 7.5 MgCl2 10 mM ATP 0.5 - 1 mM DTT 5 mM Volume 10 - 20 ml T T 4 - 15 ℃ 4 - 16 hr 1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下