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第三章 蛋白质分析 3.7 结构与构象研究 参考文献 [1] 邱德仁. 生命科学中的分析化学--蛋白质组分析.理化检验-化学分册. 2005年02期。 [2]张国安 , 许雪姣 , 张素艳 , 樊惠芝 , 杨芃原.蛋白质组的分离与分析及其应用进展.分析化学, 2003年05期 静态光散射法通过检测散射光强度及其散射角度依赖性的关系，可以得到分子的重均相对分子质量、旋转半径等重要参数； 动态光散射法则通过测定散射光中微小频移与其角度和光强随时间变化的关系，从而得到分子的平均扩散系数和平均流体力学半径，该技术具有不破坏样品及其环境、能快速跟踪体系的变化过程等优点。广泛地应用于研究生物大分子溶液中的缔合、聚集等性质。 3.7.4 Ｘ射线衍射法 由于Ｘ射线衍射法的分辨率能达到单个原子的水平，并且可以清晰地描述配体与蛋白质的作用，因此Ｘ射线衍射法是非常有效的方法，特别对于变构蛋白酶等一些特定的蛋白质。 Ｘ射线衍射法研究蛋白质结构一般是在固态（结晶状态）下进行。其测量依据是晶态蛋白质对Ｘ射线的衍射作用，即对每个晶体衍射数据（点数）来确定各个原子或原子团的空间位置，从而判断蛋白质中各个原子团以及它们与配体的相互作用。严格地说，它得到的结果是一段时间内的统计平均衍射数据。一般说来，测量时间越长、采集的衍射点数越多，则其结果越可靠。由于衍射点数与蛋白质的分子质量成正比，与晶体的分辨率的立方成反比，因此要求蛋白质的晶体结构相当稳定并对每个晶体采集相当多的衍射数据（点数）。 3.7.5 核磁共振谱法 核磁共振(Nuclear magnetic resonance, NMR)是一种多功能的物理调试技术，它在解析化学物质结构和化学反应性能上得到广泛应用。由于核磁技术可在更接近生物环境的溶液体系中进行研究,因而具有X射线不可替代的更广阔的应用前景。 高分辨率NMR技术在生物化学和分子生物学中的应用具有下列优点： (1)适用于体外(In vitro)和体内(In vivo)研究； (2)可以是液体和固体样品，如生物膜； (3)几乎所有“生物核素”(Biological nucleus)都能检测，如1H、11P，13C、15N； (4)NMR研究借以参数较多，提供的信息量大； (5)使用技术全面，应用范围广泛。具有调试灵敏，技术方法齐全，定性和半定量的特点，因此应用十分广泛。 三种芳香族氨基酸及蛋白质的紫外吸收光谱 (a) Trp, Tyr and Phe; (b) protein 蛋白质易受核酸的污染，核酸在260nm附近有强的吸收。为了消除核酸对蛋白质测定的干扰，可分别测定样品在260和280 nm处的吸光度值，然后利用两波长下的吸光度差计算蛋白质的浓度。蛋白质的浓度一般依据下列两个经验公式计算： 优点：操作简单 缺点：干扰多 Lowry-Kalekar 公式： 蛋白质浓度(mg/ml)=1.45A280-0.74A260 Warburg-Chritian公式： 蛋白质浓度(mg/ml)=1.55A280-0.76A260 式中 A260和A280分别代表样品在260，280 nm处的吸光度 与吸收光谱法相关的研究主要包括以下两方面： (1) 导数法用于蛋白质的定性和定量分析，如蛋白质及天然芳香氨基酸的鉴别； (2)蛋白质结构及构型的研究。当蛋白质的构型发生变化时，蛋白质生色基团所处的微环境发生变化，其吸收光谱随之发生变化，吸收峰将发生红移或蓝移。 利用UV差谱可以获得蛋白质构型变化的信息，如利用溶剂微扰差谱可以探测蛋白质分子中生色基团的暴露程度。 荧光光谱法 蛋白质的荧光来自于具有紫外吸收的三种氨基酸，即酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。这三种氨基酸的最大荧光发射波长分别是303、348和282nm。当这三种氨基酸的浓度相同时，色氨酸的荧光强度最大，苯丙氨酸的荧光强度非常弱。因此，蛋白质的内源性荧光主要是酪氨酸和色氨酸残基的综合贡献。值得指出的是：核酸相对于蛋白质其内源性荧光极弱，所以对于蛋白质的定量一般无影响。用荧光法对蛋白质进行定量比紫外分光光度法灵敏，且没有核酸的干扰，来自其它小分子化合物的干扰也相对较小。所以，常常在中性水溶液中于280 nm处激发，在340-350 nm附近检测荧光强度．以便对蛋白质进行定量、半定量或定性分析。 虽然荧光法具有灵敏度高的特点，但其缺陷也是显而易见的，不同蛋白质中荧光氨基酸残基的含量可能会有很大的差别，因而定量时要选择同一种蛋白质作为标难。 酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸在中性水溶液中的荧光发射光谱 2 化学方法 蛋白质在可见区无吸收，故在可见区无法利用蛋白质自身的光谱性质进行分析。但在紫外区有