苦参碱对宫颈癌hela细胞的作用.docVIP

苦参碱对宫颈癌Hela细胞的作用 【摘要】 　　目的: 观察不同浓度的苦参碱对宫颈癌Hela细胞的作用。方法: 浓度分别为0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml的苦参碱体外培养Hela细胞24h、48h、72h后，分别用MTT法观察苦参碱对Hela细胞的生长抑制作用、AnnexinV-PI双标染色用流式细胞仪检测苦参碱对Hela细胞凋亡的影响。结果：不同浓度的苦参碱具有抑制宫颈癌Hela细胞增殖的作用，呈明显的时间、剂量依赖性。各浓度和时间之间比较具有显著差异性（Plt;0.01）。FCM检测结果显示苦参碱作用后，细胞的凋亡率增加，呈现随时间和剂量依赖性。各浓度和时间之间比较也具有显著差异性（Plt;0.01）。结论：苦参碱对人宫颈癌Hela细胞的增殖具有明显的抑制作用，能诱导肿瘤细胞的凋亡。 【关键词】 苦参碱; 凋亡 　　苦参是临床常用的中药之一，是豆科植物苦参Sophora Flavescens Ait的干燥根，苦参碱类生物碱是从苦参（sophora flavescens ait）提取的具有广泛药理作用的活性物质［1］。近年研究苦参碱能抑制很多肿瘤的增殖和导致其肿瘤细胞的凋亡，在胃癌细胞SGC7901［2］、口腔上皮癌KB细胞［3］、大肠癌HT29细胞［4］和结肠癌SW1116细胞［5］中已做了大量的实验进行凋亡机制的研究，但是对宫颈癌Hela细胞的研究还未见报道。本实验旨在研究苦参碱抑制宫颈癌Hela细胞增殖和导致其凋亡的作用，探讨其对宫颈癌可能的作用机制。 　　1 材料与仪器 　　1.1 主要试剂 　　苦参碱注射液（商品名：永新）0.15g/支，购自扬子江药业集团有限公司，产品批号 RPMI1640 培养基和胰酶（EDTA），美国Gibco 公司产品；新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，噻唑蓝(MTT)染液为北京中山公司产品；Annexin VFITC/PI 凋亡检测试剂盒，Bender Medsystem 公司产品，晶美生物工程有限公司代理。 　　1.2 仪器设备 　　超净工作台，细胞培养箱（HG3033K）；倒置显微镜 OLYMPUS；流式细胞仪（Coulter Epics XL），酶联免疫监测仪（BioRad 550）。 　　1.3 细胞株 　　宫颈癌Hela细胞株由武汉大学医学院病毒研究所伍星欣教授馈赠。 　　2 方法 　　2.1 体外细胞培养 　　Hela细胞培养于含10％新生小牛血清、100U/ml青霉素、100mg/l链霉素的RPMI1640培养基中，置于5％CO2、37℃、 95%饱和湿度的恒温密闭孵箱中进行常规培养，每日观察细胞的生长情况。2～3天传代一次。 　　2.2 MTT法检测细胞生长抑制率 　　取对数生长期的Hela细胞，0.02％EDTA消化、计数，以1×l05个细胞/毫升悬液200ul/孔接种于96孔培养板，24h后加入质量浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml经生理盐水稀释的苦参碱（Mat）,对照组仅加生理盐水。孵育24、48、72h后换无血清的培养基加MTT20ul继续培养,4h后弃去培养基，每孔加二甲基亚砜200ul/孔，振荡10min，在全自动酶标仪上选择波长490nm测定吸光值（A值），计算各组细胞的生长抑制率。 细胞抑制率=（1-实验组A/对照组A）×100％，计算细胞抑制率。实验重复3次，每次、每浓度、每时段均设6个复孔。 　　2.3 AnnexinV FITC/PI双标染色，流式细胞仪测定Hela细胞的调亡率 　　收集不同浓度（0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml）、不同时间（24、48、72h）苦参碱处理后的细胞，EDTA消化，收集1×106细胞，1000r/min离心5min，弃上清，用4℃预冷的PBS洗细胞，1000r/min离心5min弃上清，共两次。用250ul结合缓冲液重新悬浮细胞。取100ul细胞悬浮于5ml流式管中，加入5ulAnnexin V/FITC和10ul20ug/ml的PI，混匀后避光孵育15min，在反应管中加400ulPBS，流式细胞仪（FCM）分析凋亡。 　　2.4 统计学处理 　　数据采用SPSS13.0统计软件分析，采用但因素方差分析进行比较，结果采用±s表示，Plt;0.05具有统计学意义。 　　3 结果 　　3.1 苦参碱对宫颈Hela细胞增殖抑制作用 　　苦参碱以时间剂量依赖方式抑制细胞的增殖。0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml的苦参碱对细胞均有明显的抑制作用，且随着培养液中苦参碱的浓度增加和培养时间