091218植物病原细菌学实验__培训课件.pptVIP

* * * 实验五 植物病原细菌的PCR分子鉴定 ? 1 了解PCR反应的原理； 掌握PCR反应的操作方法。 一、实验目的 二、PCR扩增 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR） 1、PCR技术的基本原理 　类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与目标序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火--延伸三个反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链（以便它与引物结合，为下轮反应作准备）； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 2 The procedure of PCR 5’ 5’ 3’ 3’ d.NTPs Taq Primers 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ component denaturation 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ (94℃) extension 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ Taq Taq 5’ 5’ repeated anneal (72℃) (50℃) 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 2 cycles 4 copies 3 cycles 8 copies 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 10×反应缓冲液（含Mg2＋） 5.0 ?l dNTP混合物，10 mmol/L 1.0 ?l 上游引物，20 ?mol/L 1.0 ?l 下游引物，20 ?mol/L 1.0 ?l 模板DNA 1.0 ?l Taq plus DNA聚合酶，5 U/?l 0.5 ?l 加双蒸水至终体积为50 ?l ? 3 反应体系 取一0.5 ml PCR薄壁管，依次加入以下试剂： M 1 2 3 4 ? 3kb 2kb 0.8% agrose gel electrophoresis of full length PCR product from Y160 M: DNA marker; 1: Y160; 2:positive control; 3 4: CK- 2.7kb 引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 　　 酶及其浓度：　目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 4 PCR反应操作注意事项： dNTP的质量与浓度　 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。 模板(靶基因)核酸　模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。 Mg2+浓度　Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5