提取参考DNA纯度.docVIP

试剂盒特点: 经过特殊处理的纯化柱能有效的去除杂质和腐殖酸。 兼容性强，适用于各种不同的粪便。 不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。 快速，简捷，单个样品操作一般可在60分钟内完成。 ◆ 高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.7～1.9，长度可达50kb以上，可直接用于PCR，1.DNA 提取中会污染任何物质 蛋白 糖类 RNA等。其纯度一般用核算吸收OD260/OD280（蛋白质污染）分析判断，纯DNA比值为1.8。此外用OD280/OD230估计盐离子是不是太高。 5.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不纯，含有蛋白质等杂质。在这种情况下，应加入SDS至终浓度为0.5%，并重复步骤2～8。 你取出1微升或2微升，用EB稀释100倍或50倍到100微升，OD260/280的比值在1.8-2.0是比较理想的，代表你的DNA纯度很高。波长260nm时，1OD值相当于双链DNA浓度为50μg/ml，算一下，再乘以你的稀释倍数，就是浓度了紫外吸收检测DNA浓度与纯度2007年11月13日 星期二 11:40目的： 了解紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原理，掌握测定方法。原理： 核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm，在波长260nm时，1OD值相当于双链DNA浓度为50μg/ml，单链寡核苷酸的含量为30μg/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度,还可通过测定在260nm和280nm的OD值的比值（OD260/OD280），估计核酸的纯度。纯净DNA的比值为1.8, RNA为2.0。若比值高于1.8说明DNA样品中的RNA尚未除尽，若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。 紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。试剂与仪器： 提取的质粒DNA，紫外分光光度仪。操作步骤：1) 分光光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零。2) 取质粒DNA样品2μl，用水稀释100倍，转入分光光度计的石英比色杯中。3) 在260nm和280nm分别读出样品光密度值。如果样品浓度单位为μg/μl，则样品DNA浓度为OD 值的10倍，即如ODSUB260/SUB=0.1，则样品浓度即为1μg/μl。4) 若ODSUB260/SUB/ODSUB280/SUB大于1.8，说明仍有RNA，可以考虑用RNA酶处理样品，若小于1.8，说明样品中含有蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化DNA。 先说下吸光度和比值的意义。 A280nm 是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化样品。比值=1.5相当于50％蛋白质/DNA溶液； A230nm 是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA和 RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。A230产生负值主要是由于在很低DNA 浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。在下一个测定中，需要降低样品的稀释度，A230的负值会被校正。 A260/A280和A260/A230 是核酸纯度的指示值，纯度好的DNA，在pH7-8.5 下其比值应该在2.0 或2.5，A260 / A280的比值， 用于评估样品的纯度， 因为蛋白的吸收峰是280 nm。 纯净的样品比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。 A230是多肽、芳香基团、苯酚和一些碳氢化合物的吸光度，A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、多肽、苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0 。A280是蛋白质的吸光度。 我的建议：将所提取的DNA跑琼脂糖凝胶电泳，然后回收纯化一下。 另提供一种CTAB改进法配方： 组份 Tris-HCl （pH8.0） EDTA （pH8.0） NaCl CTAB PVP40 β-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM 1.4M 3%(W/V) 5%(W/V) 2%（V/V）使用前加入 A260/A280＜1.8时，蛋白质含量偏高；1.8＜A260/A280＜2.0时，样品较纯； A260/A280＞2.0时，表明RNA或DNA碎片较多。 PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合