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免疫荧光技术的原理、分类与应用 免疫荧光技术基本原理 免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合的一项技术 以荧光素作为标记物，与已知的抗体或抗原结合、但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原 在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其存在的部位。 在实际工作中，由于荧光素标记抗体检查抗原的方法较为常用，所以一般通称为荧光抗体技术 荧光的产生 物质吸收外界能量进入激发状态，再回到稳定基态时，多余的能量会以电磁辐射的形式释放，即发出荧光，这类物质被称为荧光素。 由光激发所引起的荧光，为光致荧光 ——荧光免疫技术 由化学反应引起的荧光，为化学荧光 ——化学荧光技术 荧光素的荧光特性 停止供能，荧光现象随即终止 对光的吸收和荧光的发射具有高度的选择性 发射光的波长入射光波长 荧光效率： 发射荧光的光量子数 荧光效率= 吸收光的光量子数 荧光淬灭现象：荧光素的辐射能力减弱 合适荧光素的选择 具有与蛋白质形成共价键的化学基团 荧光效率高，标记后下降不明显 荧光与背景的色泽对比鲜明 标记后能保持生物学活性和免疫活性 标记方法简单、快速、安全无毒 免疫荧光技术的主要优缺点 优点：特异性强、敏感性高、速度快 缺点：存在非特异性染色，结果判定的客观性不足，技术程序也较复杂 根据实验方法分类 直接法 间接法 补体法 其他 直接法 将荧光标记的特异性抗体（抗原）直接加在抗原（抗体）上，经一定的温度和时间染色，水洗-干燥-封片-镜检 操作简便、特异性高、非特异性染色少 敏感性低 间接法 先用已知未标记的特异抗体（一抗）与抗原反应，再用标记的抗体（二抗）与其反应，形成抗原-抗体-抗体复合物，水洗-干燥-封镜-镜检 补体法 利用补体反应，通过形成抗原-抗体-补体复合物发射荧光 其他免疫荧光技术 时间分辨荧光免疫分析 荧光偏振免疫分析技术 时间分辨荧光免疫测定 利用具有双功能基团结构的螯合剂，将镧系元素标记到抗体（或抗原）上，经免疫反应形成复合物，由于镧系元素能发出荧光，故分离除去未结合的成分后，利用时间分辨荧光仪即可测定荧光强度，从而推测待测物含量。 时间分辨荧光测定的特点 采用脉冲光源（每秒闪烁1000次以上的疝灯），照射样品后即短暂的熄灭 以电子设备控制延缓时间，待非特异本底荧光衰退后，再测镧系荧光。 镧系元素具有较长的荧光寿命，延缓测量时间，能有效地消除非特异本底荧光(10ns)的干扰 镧系螯合物的的激发光与荧光发射峰之间的波长差异，有利于排除非特异性荧光干扰，提高检测特异性。 荧光偏振免疫分析技术 利用荧光素经单一波长的偏振光照射后吸收光能，释放出相应的偏振荧光，荧光偏振程度与荧光分子大小成正比的关系而建立的免疫分析技术 * * 抗原 标记抗体 荧光 未知抗原 未标记抗体 标记抗体 荧光 补体 标记抗补体抗体 * * *