达托霉素的HPLC的方法学研究..doc

摘要 建立达托霉素含量和有关物质的测定方法。方法以达托霉素和一些杂质为对照品，采用高效液相色谱法进行测定。色谱条件为色谱柱：Phenomenex IB-SIL C8 4.6×250mm 5μm，流速：1.0ml/min，检测波长：223nm，进样量：25μl，柱温：25℃，梯度洗脱的流动相A：称取3.4g磷酸二氢铵用1000ml注射用水溶解，用磷酸调pH至3.1，流动相B：乙腈。结果使达托霉素的线性、精密度、准确度等达到了要求。 [关键词] 含量,有关物质,线性,精密度,准确度,耐用性 目录 摘要 3 一、仪器与药品 5 二、方法建立与方法描述 5 (一)、方法建立 5 （二）、方法描述 5 三、验证内容 7 （一）系统适应性 7 （二）降解实验 8 （三）专属性 8 （四）定量限LOQ和检测限LOD 9 （五）线性 12 （六）相对校正因子的计算 18 （七） 精密度 18 （八）准确度 23 （九）溶液稳定性 26 （十）耐用性 28 四、结论 29 五、典型图谱 30 六、参考文献 30 一、仪器与药品 电子分析天平 XP205 已校正 高效液相色谱仪 Agilent 1200 已校正 磷酸二氢铵 分析纯 上海光铧科技有限公司 乙腈 色谱纯 Merck UN1648 注射用水 每日更新 本厂自制 纯化水 每日更新 本厂自制 达托霉素对照品 P1301，94.7% 本实验室内部标定 水解物 P1301，91.4% 本实验室内部标定 β-异构体 P1301，71.9% 本实验室内部标定 脱水物 P1301，86.6% 本实验室内部标定 达托霉素样品 S130301 浙江海正药业股份有限公司生产 二、方法建立与方法描述 （一）、方法建立 袁干军等曾报道达托霉素及A21978C组分的含量中提到色谱条件为色谱柱ShimadzuVP-ODS(250×4.6mm,5.0μm);梯度洗脱的流动相A:乙腈-0.05MpH7.2的磷酸缓冲液(30:70),流动相B:乙腈-0.05MpH7.2的磷酸缓冲液(70:30);流速1.0mL/min;检测波长为223nm,260nm,280nm,360nm。由于达托霉素的成品用上述方法使一些杂质分离的效果不是很理想，因此，把磷酸二氢铵缓冲盐的PH值调整为3.1，梯度也有相应的调整，检测波长使通过二极管阵列检测器(DAD)检测，在190nm～360nm区间进行DAD全波段扫描。通过DAD扫描结果显示样品在223nm附近具有最大吸收，综合考虑确定223nm为高效液相色谱仪检测波长。由于达托霉素的分子量比较大以及杂质与主峰分离效果综合考虑最终采用Phenomenex IB-SIL C8 4.6×250mm 5μm色谱柱。 （二）、方法描述 [含量] 色谱柱：Phenomenex IB-SIL C8 4.6×250mm 5μm 流速：1.0ml/min 检测波长：223nm 进样量：25μl 柱温：25℃ 进样器温度：2~8℃ 流动相A：称取3.4g磷酸二氢铵用1000ml注射用水溶解，用磷酸调节pH至3.1 流动相B：乙腈 流动相：梯度洗脱 A(%) B(%) 0 67.5 32.5 45 60 40 50 50 50 55 50 50 56 67.5 32.5 60 67.5 32.5 稀释剂：注射用水 标准溶液：精密称取达托霉素对照品25mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。 样品溶液：精密称取达托霉素样品25mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。 系统适应性：连续注射5针标准溶液，计算峰面积RSD不大于2.0%。 用下式计算达托霉素中C72H101N17O26的含量： 湿计含量%= ru × Cs×P ×100% rs Cu 式中：Cu，Cs分别是样品溶液与标准溶液的配制浓度（mg/ml） rs是标准溶液所对应的主峰峰面积 ru为样品溶液所对应的主峰峰面积 P为对照品的含量，% 无水无残溶含量计算公式： 干计含量%= 湿计含量% 1-水分%-残溶% 限度：以无水无溶剂计算，达托霉素中C72H101N17O26含量应≥93.0%。 [有关物质] 色谱条件和样品溶液同含量。 1%对照溶液：精密移取含量项下标准溶液1.0ml于100ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。 用下式计算各已知杂质、单个杂质和总杂质的含