高效液相色谱仪案例.ppt

在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂， 若组分的保留时间短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂， 使保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯 四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小) 3. 流动相选择 4. 选择流动相时应注意的几个问题 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点： 流动相对样品具有一定的溶解能力， 保证样品组分不会沉淀在柱中 ( 或长时间保留在柱中 ) 。 流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应 ( 特殊情况除外，如配位色谱等 ) 流动相的黏度要尽量小，以便降低柱压，延长色谱柱 使用的寿命 避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。 如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。 流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用 UV 检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。 流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法 正常进行。 在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相 中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量 氧与样品发生作用。 尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 ?溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、 仪器起到作用，消除由于污染对分析结果的影响。 对色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小， 溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。 对仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。 5. 流动相过滤 流动相在混合前分别滤过，特别要注意分清有机相滤膜和水相滤膜。有机相滤膜一般用于过滤有机溶剂，过滤水溶液时流速低或滤不动。水相滤膜只能用于过滤水溶液，严禁用于有机溶剂，否则滤膜会被溶解！溶有滤膜的溶剂不得用于HPLC。 流动相脱气的目的 使色谱泵的输液准确 输液均匀准确，并且脉动减小 保留时间及色谱峰面积的重现性提高 提高检测的性能 防止气泡引起的尖峰 基线稳定，信噪比增加 溶剂的紫外吸收本底降低 保护色谱柱 减少死体积 防止填料的氧化 6. 流动相的脱气 氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度 比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。 加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。 抽真空脱气法：易抽走有机相。 超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min。 在线真空脱气法（实时在线脱气，效果好） 1. 分析方法如何建立？ 色谱柱和检测器的选择 根据被分离物质性质选择；参考文献类似物质 疏水性的样品——反相键合色谱； 亲水性的样品——正相键合色谱； 流动相组成,配比,流量,梯度洗脱的选择 根据分析样品的结构、性质，并查阅相关文献确定流动相组成。 为达到较好的分离效果，确定流动相配比。 当样品中溶质组分较多及不同溶质的性质差别较大时，考虑梯度洗脱。 当分析弱酸，弱碱性化合物时，可通过采用缓冲溶液及加醋酸、三乙 胺等调节流动相 的pH值来改善峰型。 样品组分保留值和容量因子的选择 分析时间最好控制在10～30min 容量因子控制在1～10；对于容量因子范围较宽的通常使用梯度洗脱技术。 相邻组分分离度的要求： 对于难分离的样品，要求分离度R≥1.0 样品分析方法 流动相的准备 过滤：用孔径为0.22μm（0.45μm)滤膜过滤除去固体颗粒杂质。脱气：超声脱气，吹氦脱气，抽真空脱气法，在线真空脱气法 样品的准备称量，用流动相超声溶解，过滤或高速离心 2. 应用领域 目前，HPLC在有机化学、生化、医学、药物临床、化工、食品卫生、环保监测、商检和法检等方面都有广泛的用途，而在生物和高分子试样的分离和分析中更是有明显优势。 在目前已知的有机化合物中，若事先不进行化学改性， 只有20％的化合物用气相色谱法可以得到较好的分离， 而80％的有机化合物需HPLC分析。因此，HPLC具有非 常广阔的应用前景。 例1. 环境中有机氯农药残留量分析 固定相：薄壳型硅胶(37 ～50?m)