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荧光免疫标记技术 免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。 该技术的主要优缺点 主要优点：特异性强、敏感性高、速度快。 主要缺点：非特异性染色问题尚未完全解 决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。 免疫荧光技术 　　免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合。 以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合、但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。 在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。 免疫荧光技术- 基本原理 荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引起发光；停止能量供给，发光亦瞬即停止。荧光素是一种可吸收激发光的光便能产生荧光，并能作为染料使用的有机化合物，亦称荧光色素。 发生原理---基态?激发态 产生特点：激发---即刻产生 停止激发---瞬间消失 种类---光致荧光，化学荧光，X线荧光，阴极射线荧光 荧光 荧光色素:能够产生明显荧光并能作为染料使用的有机化合物称为荧光色素或荧光染料。用于标记抗体的荧光色素，必须具有化学上的活性基因，能与蛋白质稳定结合，且不影响标记抗体的生物活性及抗原抗体的特异性结合。 异硫氰酸荧光素(FITC) 荧光FITC+RB200标记 光源：高压汞灯、氙灯、卤素灯 滤板：隔热滤板、激光滤板（UG、BG）、吸收滤板（OG、GG） 光路：透射光、落射光 荧光显微镜 讨论分析 荧光显微镜台式机---FACSCalibur 双激光---488nm 635nm 四荧光参数 分选、浓缩系统 大型机---FACSVantage SE 多激光多波长八荧光参数高速分选单细胞点对点分选 基本原理---荧光显微镜；荧光Ab；标本（组织或细胞中Ag) 技术类型： 直接法---荧光素标记Ab直接检测 间接法---荧光素标记二抗 补体结合法---荧光素标记抗补体Ab 双结合法---两种荧光素标记Ab 重点 荧光免疫显微技术 间接免疫荧光检测自身抗核抗体 FALS Sensor Laser 前向角散射光（FSC）：反映细胞的大小 荧光免疫显微技术 FALS Sensor 90LS Sensor Laser 侧向角散射光（SSC）：反映细胞内的颗粒多少 荧光免疫显微技术 双色直接染色细胞 T细胞 B细胞 荧光免疫显微技术 直方图分析：对细胞的某一个单参数进行统计分析 横坐标为荧光或散射光强度 纵坐标为细胞数 荧光免疫显微技术 间接免疫荧光法示意图