鼠源单克隆抗体技术__培训课件.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 廖振林 食品学院 Preparation by size: gel filtration chromatography 廖振林 食品学院 Preparation by charge: ion exchange chromatography 廖振林 食品学院 Preparation by specific binding: affinity chromatography 廖振林 食品学院 单克隆抗体在医学中的应用 检验医学诊断试剂 （1）病原微生物抗原抗体的检测 （2）肿瘤抗原的检测 （3）免疫细胞及其亚群的检测 （4）激素测定 （5）细胞因子的测定 蛋白质的提纯 肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术 廖振林 食品学院 基因工程抗体与抗体库技术 单抗体内应用和疗效受限原因： 1.鼠源性单抗对人体有较强的免疫原性 2.注入人体的单抗在肿瘤部位的摄取量甚少 3.生产成本高,难于普及应用 廖振林 食品学院 人杂交瘤技术未获真正突破原因: 融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫 基因工程抗体：用基因工程技术改造现有优良的鼠单抗基因，着眼点在于尽量减少抗体中的鼠源成分，但又尽量保留原有的抗体特异性。 抗体库技术：用细菌克隆取代B细胞克隆表达抗体，不经细胞融合，甚至不经免疫，制备针对任何抗原的单克隆抗体。 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 廖振林 食品学院 免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性B细胞，此时血清中抗体效价不一定最高。 可溶性抗原10-15ug/100ul+等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔 2-4周后加强免疫（量减半，改用不完全佐剂，可反复多次） 冲击免疫（融合前3天进行） 选用6-12周龄Balb/c小鼠　 廖振林 食品学院 颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂 目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。 　　 廖振林 食品学院 骨髓瘤细胞系选择要点： 稳定易培养、自身不分泌Ig、融合率高、HGPRT缺陷株 常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 等。 保存：防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤） 防止支原体污染（胎牛血清） 融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％ 融合比例 脾细胞：骨髓瘤细胞=3：1许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中 常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞 饲养细胞一般在融合前一天制备 廖振林 食品学院 廖振林 食品学院 免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天后的脾脏。 融合比例： 骨髓瘤细胞：脾细胞=1：5或1：10 融合剂：40%PEG（分子量1000-2000） 融合24小时后加HAT培养液 2周后 改用HT培养液 2周后 改用一般培养液 廖振林 食品学院 一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时，开始检测特异性抗体，筛选出所需杂交瘤细胞系。 可靠的筛选方法须在融合前建立，避免由于方法不当贻误筛选时机。 廖振林 食品学院 克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。 克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次 克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法 阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污染 廖振林 食品学院 有限稀释法 从阳性分泌孔中收集杂交瘤细胞，经过逐步稀释，使每孔只有一个细胞。 廖振林 食品学院 单克隆抗体制备具体步骤 单克隆抗体是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。 廖振林 食品学院 廖振林 食品学院 廖振林 食品学院 一、抗原与动物免疫 制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于免疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫。 有的抗原可以用化学合成：地高辛 多数抗原物为混合物须经免疫、筛选、克隆化。 廖振林 食品