冷冻电子显微镜技术在生物大分子的三维结构研究中的应用.docVIP

冷冻电子显微镜技术 在生物大分子的三维结构研究中的应用 北京大学医学部生物物理系 汪国良 摘要 冷冻电子显微镜技术的快速发展，使其在生物大分子的结构研究中得到越来越广泛的 应用。对于具有二维晶体结构的生物样品，能够得到其高分辨率的三维重构图像，并直接用 于解析其空间结构信息；对于非晶体的样品，虽只能得到低分辨率的三维重构图，但可以为 高分辨率的 X-射线晶体学和核磁共振波谱学所得到的亚结构提供模型。此外，通过捕获样 品在不同状态的结构信息，研究其构象的动态变化与其功能的关系。本文从样品准备、数据 采集、数据处理等步骤，对冷冻电子显微镜技术在生物大分子的三维结构研究中的应用进行 综述，并举例说明这项技术的优越性。 关键词 冷冻电子显微镜、电子晶体学、单颗粒、电子断层学、三维重构 冷冻电子显微镜技术（cryoelectron microscopy）是从 20 世纪 70 年代提出的，经过近 10 年的努力，在80 年代趋于成熟。它的研究对象非常广泛，包括病毒、膜蛋白、肌丝、蛋 白质核苷酸复合体、亚细胞器等等[1]。一方面，冷冻电子显微镜技术所研究的生物样品既 可以是具有二维晶体结构的，也可以是非晶体的；而且对于样品的分子量没有限制。因此， 大大突破了 X-射线晶体学只能研究三维晶体样品和核磁共振波谱学只能研究小分子量（小 于100KDa）样品的限制。另一方面，生物样品是通过快速冷冻的方法进行固定的，克服了 因化学固定、染色、金属镀膜等过程对样品构象的影响，更加接近样品的生活状态。现在， 冷冻电子显微镜都具备自动图像采集系统。CCD(charged-couple device)照相机能快速、动态 的记录电子衍射图，但由于像素的限制，其分辨率不如照相胶片。CCD 和照相胶片所记录 的是生物样品空间结构的二维投影，利用各种计算机软件程序包，可以从电镜的二维图像重 构样品的三维结构，即三维重构。现已开发出许多软件程序包可供计算机处理使用，大大方 便了生物样品的结构重构[2]。 一、样品准备 用于冷冻电镜研究的生物大分子样品必须非常纯净。生物样品是在高真空的条件下成像 的，所以样品的制备既要能够保持本身的结构，又能抗脱水、电子辐射。一种方法是通过快 速冷冻使含水样品中的水处于玻璃态，也就是在亲水的支持膜上将含水样品包埋在一层较样 品略高的薄冰内。该方法有两个关键步骤：一是将样品在载网上形成一薄层水膜；二是将第 一步获得的含水薄膜样品快速冷冻。在多数情况下，用手工将载网迅速浸入液氮内可使水冷  冻成为玻璃态。其优点在于将样品保持在接近“生活”状态，不会因脱水而变形；减少辐射 损伤；而且通过快速冷冻捕捉不同状态下的分子结构信息，了解分子功能循环中的构象变化 [3]。另一种方法是通过喷雾冷冻装置（spray-freezing equipment），利用结合底物混合 冰冻技术 (spray-freezing)，可以把两种溶液（如受体和配体）在极短的时间内混合起来 (ms 量级)，然后快速冷冻，将其固定在某种反应中间状态，这样能对生物大分子在结合底 物时或其他生化反应中的快速的结构变化进行测定，深入了解生物大分子的功能。 [4]。 二、数据采集 冷冻的样品通过专门的设备——冷冻输送器转移到电镜的样品室。在照相之前，必须观 察样品中的水是否处于玻璃态，如果不是则应重新制备样品。由于生物样品对高能电子的辐 射敏感，照相时必须使用最小曝光技术（minimalexposuretechnic）。要得到高分辨率的 电镜图像，照相时累积的电子剂量不能超过临界剂量 1000 到 2000e-nm-2;中等分辨率的电 镜图像图像不能超过临界剂量 10000e-nm-2。最小曝光技术要求首先在低放大倍数下寻找合 适的区域；光学对位和聚焦应在邻近照相的区域进行[5]。一般情况下，用感光胶片记录图 像。感光胶片和CCD记录的都是样品在垂直于电子束方向的二维投影像。由于象素的限制， SSCCD(slow-scan charged-coupled device)照相机拍摄的图像的分辨率不能和胶片记录的 图像相比较，但是能更快速的反馈信息，因为胶片只有从电镜中取出，经化学处理后才能观 察。而且SSCCD在记录动态变化、线性、背景噪音等方面优于感光胶片[6]。一些因素如： 辐射损伤、电子束诱导的样品漂移和放电、电子束不均一等都能引起图像质量的下降。低剂 量照相技术能尽可能的减少电子束辐射损伤；而将样品保持在液氦的温度能进一步的保护样 品。 具有200KV或更高加速电压并装备场发射枪（fieldemissiongun）的现代电镜较100kv 加速电压和热发射枪（thermionic electron gun）的传统电镜有很大的优越性。场发射枪 产生的电子束具有更好的时间、空间