第2节动物细胞培养技术范例.ppt

第二节 动物细胞培养技术 一、 动物细胞培养的特点 （一）动物细胞特点 无细胞壁 倍增时间长，生长缓慢 培养中需氧量少，对搅拌敏感 多以聚集体存在 原代细胞培养50代即开始退化 细胞连接复杂 （二） 动物细胞培养定义 动物细胞与组织培养是从动物体内取出 细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无 菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞 或者组织生存、生长并维持结构和功能的一 门技术。 体外培养分类: 1)原代培养(初代培养) 指将机体取出的细胞或组织进行实效培养 的过程. 实效培养的细胞一般增殖10代左右. 原代培养的细胞称为原代细胞. 2)传代培养(继代培养) 由初代培养产生的能进行无限次传代培 养的细胞群称细胞系. 体外培养的细胞与体内的起源细胞在形 态和功能方面都存在一定的差异,甚至经过长 期稳定的传代培养后还会产生一些变异. 二、体外培养细胞基本技术 体外培养特点 体外培养工具 体外培养条件 体外细胞生长增殖过程 培养方法 大规模培养技术 （一）体外培养特点 1.营养条件苛刻 除一般的营养物质外,还要血清. 2.适应性差, 对环境敏感 包括对PH、溶解氧、二氧化碳等。 3.培养时间长，易污染 主要是生长缓慢;显著的污染是培养基的 PH迅速改变. （二）体外培养工具 1.空心纤维: 是一种由醋酸纤维素和硝酸纤维素混合物 所织成的可透性滤膜,外径1/3----1/4mm。 （二）体外培养工具 2.微球: 直径小、密度大的固体颗粒，常通过搅拌 使无悬浮状态的细胞附于颗粒表面单层生长。 （三）体外培养条件 温度：37度 pH：7.2-7.4 气体：氧，二氧化碳，氮气 营养条件：培养基 需要多种氨基酸，维生素，辅酶，核酸， 嘌呤，嘧啶，激素和生长因子，其中多种成分 可以由血清提供。 关于培养基 1）天然培养基 多为动物体液或组织提取液,主要有血清、 鸡胚汁、组织提取液。 常配制成0.5%溶液,偏酸性 2）合成培养基 据细胞种类和生长条件不同而异 合成培养基中常要添加一部分天然培养基. 多加入小牛血清. 3)无血清培养基 加入适宜的促细胞生长因子,保证细胞的 良好生长. 此外,动物细胞培养还必需一些溶液.如 ①平衡盐水:维持渗透压;调控酸/碱平衡 ②PH调整液:3.7%/5.6%/7.4%NaCO3、HEPES ③0.02%EDTA溶液：对细胞进行非酶性解离 ④抗生素:防止微生物污染 如青-链霉素、卡那霉素等 （四）体外细胞生长增殖过程 原代培养期 细胞活跃，分裂但不旺盛 传代培养期 细胞增殖旺盛，可10-50次增殖 衰退期 细胞基本不增殖，并开始衰退凋亡 （五）培养方法 1）悬滴培养法:1907年哈里森创立。 2）旋转管培养法:1933-1934盖尔和刘易斯建立 3) 灌注小室培养法:1912年伯罗设计 4) 培养瓶培养法 5) 培养板培养法 三、现代动物细胞培养技术 依培养过程而言： 原代培养、传代培养 依培养方法而言： 贴壁培养、悬浮培养、微载体培养、 多孔载体培养、微囊化培养、 中空纤维法 Ⅰ、原代培养技术 组织块原代培养 组织消化培养（单层培养法） （1）组织块原代培养技术 剪切：剪碎、Hanks液清洗(青链霉素杀菌)、 1mm3碎块、静置沉降 摆布：于培养瓶底部单层摆布组织小块 （间隔0.5cm） 风干：倒转培养瓶（塞瓶）于36.5°C温箱 培养2小时(不超过4小时) 培养:加入少许培养液覆盖组织后静置培养 关于Hanks液 (2)组织消化培养技术 准备：用品消毒、洗手、75%擦拭手至肘部 剪切：剪碎、Hanks液清洗(青链霉素杀菌30-60 min)、2-3mm3碎块 消化：加入30-50倍组织体积的0.25%的胰蛋白 酶溶液，于37°C水浴或温箱消化并每 10min左右摇动一次（最好磁力搅拌）。 消化时间依组织块大小而异 (2)组织消化培养技术 离心、计数：500-1000rpm、5min；倒置显微镜 下计数（单层覆盖瓶底）。 培养：向合成培养基上接种消化后的单层细 胞，于37°C、CO2培养箱（瓶塞用透气 无菌棉塞）中培养。 监控：1-2天后镜检（细胞形态）；培养液pH值 （正常呈桃红色，pH7.2-7.4；若发黄 说明偏酸，更换培养液） 磁力搅拌器 CO2培养